Investigation on the functional effects of platelet-derived extracellular vesicles on Glioblastoma Multiforme cell lines
Il glioblastoma multiforme (GBM) è il tumore cerebrale primario più comune e aggressivo ed è caratterizzato da un'elevata resistenza ai trattamenti e da un alto tasso di morbidità e mortalità. L'interazione tra le cellule tumorali e il microambiente tumorale (TME) gioca un ruolo fondamentale nel processo di tumorigenesi, e, in questo contesto, le piastrine circolanti sono considerate attori importanti nella regolazione della progressione tumorale. In vivo, le cellule tumorali possono indurre l'attivazione delle piastrine sia direttamente sia attraverso l'induzione di uno stato infiammatorio generale. Tale attivazione piastrinica è accompagnata dal rilascio di diversi componenti bioattivi che, a loro volta, possono modulare la crescita e la diffusione del cancro. In questo contesto, le vescicole extracellulari di derivazione piastrinica (PEVs) rilasciate dalle piastrine attivate sono note per partecipare alla progressione del cancro e mediare la comunicazione TME-cancro trasportando molecole di derivazione piastrinica alle cellule bersaglio, inducendo così risposte funzionali. È stato dimostrato che le PEVs possono influenzare il comportamento di diversi tipi di cellule tumorali, modulando in ultima analisi la progressione del tumore. Tuttavia, ad oggi la relazione tra le piastrine, PEVs e cancro rimane poco chiara e, in particolare, non sono disponibili informazioni sulle lore possibili funzioni nel GBM.
In questo studio ci siamo posti l'obiettivo di verificare se le PEVs potessero interagire, fisicamente e funzionalmente, con le cellule di GBM. Le PEVs rilasciate da piastrine stimolate con trombina, caratterizzate in via preliminare in termini di distribuzione dimensionale e contenuto proteico, sono state incubate con le tre linee cellulari di GBM U251, T98G e U87. Mediante l'analisi di immunofluorescenza abbiamo dimostrato la capacità generale delle cellule di GBM di interagire con le PEVs. Tale interazione non è stata influenzata dalla privazione di siero ed è stata più pronunciata nelle linee cellulari U251 e U87, rispetto alle cellule T98G. Mediante un'analisi di immunoblotting, abbiamo osservato che l'interazione con le PEVs non era accompagnata da un'alterazione significativa dei livelli di fosforilazione di importanti proteine di segnalazione (FAK/PYK2, Akt/mTOR/GSK3 e MAPK). È interessante notare che il saggio MTT ha rivelato che le PEVs hanno indotto una riduzione significativa dose- dipendente del segnale MTT in tutte le linee cellulari di GBM. Tuttavia, il saggio di apoptosi ha mostrato che i trattamenti con PEVs non hanno avuto un impatto significativo sulla vitalità cellulare, ad eccezione di un moderato aumento della necrosi delle cellule T98G. Infine, esperimenti preliminari di migrazione transwell hanno mostrato che la mobilità delle cellule GBM non è stata né aumentata né ridotta dall9interazione con PEVs.
In conclusione, il nostro studio ha dimostrato l'interazione fisica è funzionale tra linee cellulari di GBM e PEVs, evidenziando un potenziale ruolo di questi prodotti piastrinici nella tumorigenesi. Tuttavia, questi risultati preliminari devono essere confermati ed estesi per comprendere il possibile ruolo delle piastrine e delle PEVs nella progressione del GBM e nella risposta alla terapia.
Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumor and it is characterized by a high morbidity and mortality rate, showing a high resistance to the treatments. In the process of tumorigenesis, the interaction between cancer cells and tumor microenvironment (TME) plays a key role and, in this context, blood platelets are now considered important players in regulating tumor progression. In vivo, cancer cells can induce platelet activation both directly and through the induction of a generally inflammatory condition. Such platelet activation is accompanied by the release of several bioactive components that, in turn, can modulate cancer growth and dissemination. In this context, platelet-derived extracellular vesicles (PEVs) released by activated platelets are known to participate to cancer progression and mediate the TME-cancer communication by transporting platelet-derived molecules to target cells, thus inducing functional responses. It has been shown that PEVs can influence the behavior of different cancer cell types, ultimately modulating tumor progression.
However, to date the relationship between platelets, PEVs and cancer remains unclear and, in particular, there is no information available about their possible functions in GBM. Therefore, in this study we aimed at investigating whether PEVs could interact, physically and functionally, with GBM cells.
PEVs released from thrombin-stimulated platelets, preliminary characterized in terms of size distribution and protein content, were incubated with the three GBM cell lines U251, T98G and U87. By immunofluorescent analysis we demonstrated the general ability of GBM cells to interact with PEVs. Such interaction was not influenced by serum starving and was more pronounced in U251 and U87 cell lines, than T98G cells. By immunoblotting analysis, we found that interaction with PEVs was not accompanied by significantly alterations in the phosphorylation levels of important signaling proteins (FAK/PYK2, Akt/mTOR/GSK3 and MAPKs). Interestingly, the MTT assay revealed that PEVs induced a dose-dependent, significant reduction of the MTT signal in all GBM cell lines. However, the apoptosis assay showed that PEV treatments did not significantly impact cell viability, excepts for a moderate increase in T98G cells necrosis. Lastly, preliminary transwell migration experiments showed that the mobility of GBM cells was neither increased, nor reduced by the interaction with PEVs. In conclusion, our study demonstrated the physical and functional interaction between GBM cell lines and PEVs, highlighting a potential role of these platelet products in tumorigenesis. Nevertheless, these preliminary results certainly need to be confirmed and extended to understand the possible role of platelets and PEVs in the GBM progression and response to therapy.