Calcium Buffering Protein, PEF1, drives nuclear condensates in response to Doxorubicin-induced stress
I condensati cellulari possono essere considerati organelli privi di membrana e sono strutture dinamiche cruciali per una varietà di processi cellulari. A differenza degli organelli delimitati da membrana, i condensati possono costituire ambienti biochimici dinamici grazie alle loro caratteristiche biofisiche. Infatti, queste strutture si basano su interazioni reversibili, che consentono loro di adattarsi rapidamente ai cambiamenti delle necessità cellulari. Queste proprietà uniche rendono i condensati essenziali per processi ad alta variabilità come la regolazione dell'RNA, la risposta allo stress e la trasduzione del segnale. Guardando i segnali che possono indurre la formazione di condensati, secondi messaggeri come l’AMP ciclico e il calcio sono stati coinvolti. Tuttavia, i meccanismi precisi con cui essi, e il modo particolare il calcio, modula le dinamiche e la funzione di condensati rimangono poco chiari.
L'obiettivo principale di questa tesi era chiarire i fattori che governano la formazione di condensati costituiti dalla proteina della famiglia Penta EF-hand 1, PEF1. Il nostro studio ha mirato ad esaminare le proprietà dipendenti dal Ca2+ che guidano la distribuzione di PEF1, e a determinare come questo messaggero modula il processo di condensazione e le implicazioni funzionali deei condensati di PEF1 in diversi contesti cellulari.
Il comportamento di PEF1 in risposta al calcio è stato studiato utilizzando un programma di ricerca multifattoriale, che include lo sviluppo di un biosensore FRET per il calcio, microscopia confocale abbinata sia a cellule vive che immunofluorescenza, metodi biochimici classici (Western Blotting) e analisi di intensità fluorescente. PEF1 è stato targato con GFP oppure fuso al biosensore FRET per il calcio (D3mC3+16). Grazie a questi costrutti abbiamo potuto monitorare in tempo reale sia le variazioni di calcio che i loro effetti sulla distribuzione subcellulare di PEF1. In aggiunta immunofluorescenza è stata utilizzata per visualizzare le dinamiche di PEF1 endogeno. Le nostre analisi hanno dimostrato che la proteina PEF1 risponde a elevazioni di calcio spostandosi nucleo dove forma condensati. In aggiunta, abbiamo scoperto che elevazioni di calcio dovute a danno al DNA (Doxorubicina) sono sufficienti a indurre la formazione di condensati nucleari di PEF1 implicando queste strutture alle risposte cellulari allo stress.
Membrane-less organelles (MLOs) are dynamic structures crucial for a variety of cellular processes. Unlike the membrane-bound organelles, MLOs can establish dynamic, yet distinct biochemical environments. These structures are based on reversible, membrane-free interactions, which allow them to rapidly adapt to changes in cellular needs. These unique properties make MLOs essential for a variety of processes such as RNA regulation, stress response, and signal transduction. Calcium, a key regulator of numerous cellular functions, has been linked to the formation of MLOs. However, the precise mechanisms by which calcium modulates the dynamics and functions of certain MLOs remain unclear. Understanding this interaction is critical for elucidating the role of MLOs in cellular physiology and signalling.
The primary objective of this research was to elucidate the triggers that govern the Penta EF-hand family protein 1, PEF1, and its ability to form membrane-less condensates in response to calcium fluctuations. This study aims to examine the calcium-dependent properties that drive PEF1 phase separation, determine how calcium modulates these processes, and assess the functional implications of PEF1 condensate formation in different cellular contexts.
To investigate the behaviour of PEF1 in response to calcium, we employed a multifaceted methodology, including cloning, FRET-based calcium biosensing, immunofluorescence microscopy, and fluorescent intensity analysis. PEF1 was tagged with GFP and fused to the FRET-based calcium biosensor D3mC3+16 to monitor real-time calcium interactions in response to different calcium manipulations. Immunofluorescence was used to visualize PEF1 dynamics, while fluorescent intensity analysis provided insights into PEF1 localization and dynamics in response to various calcium manipulations.
Our findings suggest that doxorubicin-induced calcium imbalance may be a driving factor in the formation of nuclear puncta via PEF1. We propose a model where prolonged calcium overload in the cell triggers PEF1-driven biomolecular condensates as a mechanism to restore calcium homeostasis.