I nuovi farmaci emergenti: gli Anticorpi Monoclonali Simulazioni di dinamica molecolare per studiare gli ensembles dei CDR loops in soluzione.

Gli anticorpi monoclonali si sono rivelati protagonisti del mercato farmaceutico globale. Grazie alla loro abilità di legare targets specifici, possono essere considerati un innovativo ed efficiente mezzo per sconfiggere i patogeni. Una caratterizzazione strutturale e funzionale è richiesta per aumentare la loro specificità e per progettare anticorpi con proprietà di legame uniche. In particolare, le regioni determinanti la complementarietà (CDRs) sono cruciali per il legame dell'anticorpo all'antigene di interesse. Ad eccezione del CDR-H3 loop, che rimane difficoltoso da predire per la sua elevata diversità, le conformazioni della catena principale, o backbone, dei CDR loops sono state classificate in strutture canoniche, in base alla loro lunghezza e alla composizione aminoacidica, per migliorare la previsione e il design della struttura dell'anticorpo. Il database PyIgClassify determina dei clusters conformazionali, basati sulla lunghezza e sequenza del CDR descritto con la nomenclatura IMGT, calcolando gli angoli diedri φ e ψ tra i residui in ogni CDR loop. Usando le strutture ottenute con raggi X dei cluster più popolati come punti di partenza, sono state svolte simulazioni di metadinamica a temperatura costante, seguite da simulazioni di dinamica molecolare. L'analisi della diversità conformazionale dei CDR loops permette di identificare le probabilità e le tempistiche delle transizioni tra le conformazioni dei CDR loop della stessa lunghezza. Inoltre, sono fornite informazioni sulla cinetica degli ensemble dei CDR loops in soluzione. In accordo con i precedenti studi focalizzati sul CDR-L3 loop, sono state osservate transizioni tra i cluster canonici nei micro-millisecondi. Non solo la maggior parte dei rappresentati dei cluster canonici è campionata, ma diverse strutture mediane ai raggi X dei clusters canonici appartengono allo stesso minimo cinetico in soluzioni, quindi possono essere combinate. Le simulazioni di metadinamica sono solo una delle varie tecniche di campionamento potenziato che possono essere usate per accelerare rari eventi. Con lo stesso scopo, altre funzioni potenziali di bias possono essere applicate per forzare un sistema a fuggire da un minimo locale e esplorare uno spazio più ampio nello scenario energetico. Un'innovativa e promettente tecnica di campionamento potenziato è la Bias Exchange Metadynamics. In questo lavoro, è stata applicata a due anticorpi, potenziando tutti i CDR loops separatamente, per analizzare i cambiamenti nella struttura degli anticorpi dopo il processo di maturazione dell'affinità. Le traiettorie ottenute sono state analizzate per caratterizzare le conformazioni che il paratopo può adottare. Come è stato precedentemente osservato, la maggior parte delle strutture dei rappresentanti dei cluster canonici è campionata, e può essere assegnata ad un certo cluster, sulla base di similarità geometriche e cinetiche. Un'altra importante caratteristica che gioca un ruolo fondamentale nella disposizione del paratopo è l'angolo all'interfaccia tra la catena pesante (VH) e leggera (VL) nella regione Fv. Variazioni nella sequenza permettono ai domini VH e VL di assumere un range variegato di orientazioni l'uno relativamente all'altro. Quindi, è sicuramente degno di interesse considerare la distribuzioni degli angoli all'interfaccia, dal momento che può influenzare l'affinità allosterica del legame con l'antigene. Quindi, gli angoli all'interfaccia dei macrostati risultanti dalle simulazioni cMD sono stati analizzati e abbiamo identificato una correlazioni tra le diverse conformazioni dei CDR loop e l'orientazione VH/VL. Dato il ruolo centrare dei CDR loops nel riconoscimento dell'antigene, le dinamiche dei loops devono essere sistematicamente analizzate anche in studi futuri.

Monoclonal antibodies are emerged to be leading treatments in the global pharmaceutical market. Thanks to their ability to bind specific targets, they can provide an innovative and efficient way to defeat pathogens. A structural and functional characterization is required to enhance their specificity and to engineer antibodies with unique binding properties. In particular, the complementarity determining regions (CDRs) are crucial for the binding of the antibody to the antigen of interest. The CDRs consist of six hypervariable loops that shape the paratope. Except for the CDR-H3 loop, which still remains challenging to predict due to its high diversity, the backbone conformations of the CDR loops have been classified into canonical structures according to their length and sequence composition, in order to improve antibody structure prediction and design. PyIgClassify database assigns conformational clusters by determining the CDR sequences and lengths using the IMGT nomenclature and calculating the dihedral angles φ and ψ of the residues in each CDR. Using median X-ray structure of the high populated canonical clusters as starting point, well-tempered metadynamics simulations were performed, followed by molecular dynamics simulations. The analysis of the conformational diversity of the CDR loops allows to identify transition probabilities and timescale between canonical CDR loop conformations of the same length. In addition, kinetic information about the CDR loop ensembles in solution for all the CDR loops are provided. According to the results of previous studies that focused on the CDR-L3 loop, canonical cluster transitions in the micro-to-millisecond timescale are observed. Not only the majority of the canonical cluster representatives are sampled, but various canonical cluster median X-ray structures belong to the same kinetic minimum in solution and thus might be combined. Metadynamics is only one of various enhanced sampling techniques that can be used for accelerating rare events. With the same aim, other bias potential functions can be applied to force the system to escape from a local minimum and explore a broader space in the energy landscape. An innovative and promising enhanced sampling technique is Bias Exchange Metadynamics. In this work, it is applied to two antibodies, biasing every CDR loop separately, to analyse the changes in the antibody’s structure upon the affinity maturation process. The obtained trajectories are analysed to characterize the conformations that the paratope can adopt. As it has been seen before, the majority of the canonical representative structures are sampled, and can be assigned to a certain cluster based on geometrical and kinetic similarities. Another important feature that plays a central role in the arrangement of the paratope is the interface angle between the heavy chain (VH) and the light chain (VL) in the Fv region. Sequence variations allow the VH and VL domains to inhabit a range of orientations relative to one another. Thus, taking the distribution of the interface angles in a simulation into account is definitely worthy, since it can affect the antigen binding affinity allosterically. Therefore, the interface angles of the macrostates resulting from cMD simulations have been analysed and we identified a correlation between different CDR loop conformation and the VH/VL orientation. Given the central role of the CDRs in the antigen recognition, the dynamics of these loops should be systematically analysed in future studies.