Come naturale prosecuzione della mia precedente tesi triennale, ho svolto il mio lavoro di ricerca magistrale nel laboratorio di biologia strutturale dell'Università di Pavia, sotto la supervisione del Prof. Andrea Mattevi. Il progetto di ricerca che ha portato alla stesura di questa tesi ha avuto lo scopo di descrivere dal punto di vista biochimico e strutturale la NADPH ossidasi 5 (NOX5). Le NADPH ossidasi (NOX) sono una famiglia di proteine integrali di membrana composte, nell'uomo, da sette membri (NOX1-5 e DUOX 1-2). La loro peculiare funzione enzimatica è dedicata esclusivamente alla generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), cosa che, data la recente rivalutazione della ROS Biology, le rende degli oggetti di studio estremamente interessanti. L’alterata regolazione dei livelli di ROS prodotte dalle NOX disturba infatti l'equilibrio dei processi di signaling cellulare di tipo redox, che spesso si inseriscono all’interfaccia tra i fenomeni fisiologici e quelli invece di natura patologica. Le NOX esplicano la propria funzione biologica trasferendo elettroni attraverso le membrane cellulari. A partire dall'ossidazione del substrato, il NADPH intracellulare, gli elettroni sono trasportati, uno alla volta, mediante un FAD e due gruppi eme, fino a una molecola di ossigeno extra-cellulare, l'accettore finale, che viene a sua volta ridotto a superossido. Il superossido è, di fatto, precursore di molte altre ROS. Tutte le NOX condividono il medesimo core catalitico, la struttura principalmente coinvolta nel trasferimento di elettroni, composto di un dominio C-terminale deidrogenasico (DH), contenente il sito di legame per il NADPH e una regione di legame per il FAD, e un dominio transmembrana (TM) composto da sei eliche altamente conservate. In quanto unico membro della famiglia NOX composto di una singola catena peptidica e che non necessiti di altre proteine per la propria attivazione, NOX5 è stata subito considerata un ottimo target ai fini della ricerca. Mentre la regolazione di NOX1-4 dipende principalmente, infatti, da proteine accessorie, NOX5 (e le DUOX) si affidano invece esclusivamente al proprio dominio N-terminale. Questo dominio N-terminale regolatorio, chiamato dominio EF per via dei suoi quattro motivi di legame al calcio comunemente noti come “EF-hands", è il principale fattore di attivazione di NOX5. Grazie agli esperimenti condotti nel corso del mio periodo di internato, dopo aver proceduto con l’espressione e la purificazione dei domini di interesse, alla fine del 2019 abbiamo quindi avuto modo di pubblicare alcuni rilevanti risultati riguardanti gli stati conformazionali del dominio EF (l’apo-stato privo di calcio e l'olo-stato provvisto di ioni calcio legati) attraverso analisi di HDX e NMR. Abbiamo inoltre anche cercato di chiarire e interpretare l’interazione, riportata in letteratura, dello stesso EF con il dominio DH mediante HDX. il ruolo di mediare questa interazione tra l’N-terminale e il C-terminale di NOX5 è stato identificato nel segmento chiamato REFBD (regulatory EF-hand-binding domain), ampiamente conservato anche tra i membri delle NOX sprovvisti di EF. A partire da queste premesse, abbiamo quindi sviluppato l'idea di eseguire esperimenti di mutagenesi sito-specifica della regione aminoacidica REFBD (D610-T633) e di una seconda regione della nostra proteina modello CsNOX5 (Cylindrospermum stagnale), nota come PhosR, anch’essa altamente conservata all’interno della famiglia delle NOX. L'ortologo cianobatterico CsNOX5 è stato preso a modello per via della significativa identità di sequenza (37%) con NOX5 umana, di cui mancano dati strutturali. Particolarmente rilevante nello studio è stata la scoperta di una proteina mutata caratterizzata da un'aumentata attività. Diversi protocolli di isolamento dei costrutti sono stati esplorati, e sono qui descritti, insieme alla caratterizzazione strutturale biochimica preliminare di NOX5.
As a natural continuation of my previous thesis, I have conducted my master research work in the Structural Biology laboratory of the University of Pavia, under the supervision of Prof. Andrea Mattevi. The research project that led to this thesis script was aimed at describing from a chemical and structural points of view NADPH oxidase 5 (NOX5). NADPH oxidases (NOXs) are a family of integral membrane proteins composed, in humans, by seven members (NOX1-5 and DUOX 1-2). Their peculiar enzymatic function is exclusively dedicated to the generation of reactive oxygen species (ROS), which makes them extremely interesting since the recent re-evaluation of ROS biology. Dysregulation of NOX-derived ROS levels disturbs indeed the equilibrium of redox signalling between physiological and pathological phenomena, contributing to the development of cancer, fibrosis, and cardiovascular diseases. NOXs move an electron across cellular membranes from intracellular NADPH oxidation by transferring it, via an FAD and two hemes, until an extracellular oxygen molecule, the final acceptor, is reduced to superoxide. Superoxide is indeed precursor for many other ROS. From the current state of art, all the NOXs share the same catalytic core as the main structure involved in the electron transfer. Starting from the C-terminal dehydrogenase domain (DH), the catalytic core includes an NADPH-binding site, followed by a FAD-binding region and a transmembrane domain (TM) composed by six conserved transmembrane helices with two heme groups. NOX5 shares with the other members of NOX enzymes the common catalytic core and it has immediately been considered a good research target due to its convenient unique characteristic among NOXs to be a single peptide chain. NOX5 is indeed the one member of the family that does not require other accessory proteins for activation. While NOX1-4 regulation depends mostly on accessory proteins, NOX5 and DUOX rely on their own N-terminal domain for activation. This regulatory N-terminal domain, called EF domain because of its four calcium binding motifs known as EF-hands, is the main factor in the activation of NOX5. At the end of 2019, we published some breakthrough results from the analysis by structural techniques, such as Hydrogen Deuterium Exchange (HDX) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy, demonstrating the two conformational states of the regulatory domain: the calcium-free apo-state, and the holo-state with four calcium ions bound. Furthermore, by using HDX we also got some initial insights on the EF binding site on the catalytic DH domain. The principal goal of our research has been indeed to investigate this interaction. The REFBD segment, whose role is to mediate the interaction between the N-ter and the C-ter of NOX5, has been identified in literature and it is well-conserved among the NOX family. Thus, we developed the idea to perform site-directed mutagenesis on specific residues of the REFBD region (D610-T633) and another relevant region of Cylindrospermum stagnale NOX5 (CsNOX5) called PhosR (E493-G509) to clarify NOX5 regulation via DH and EF interaction. Structural data of human NOX5 are not yet available, but the recent structure of the cyanobacterial ortholog (CsNOX5) can be used as a model, by virtue of the significant sequence identity (37%) with the human NOX5. We proceeded with the purification of the full-length bacterial wild-type and mutants NOX5 to be able to study their catalytic activity and test the feasibility for future cryo-electron microscopy studies. Several methods for protein isolation were investigated and are hereby described, together with the biochemical and preliminary structural characterization of NOX5.
Biochemical and Structural Characterization of the NADPH oxidase 5
TODESCA, SOFIA
2019/2020
Abstract
Come naturale prosecuzione della mia precedente tesi triennale, ho svolto il mio lavoro di ricerca magistrale nel laboratorio di biologia strutturale dell'Università di Pavia, sotto la supervisione del Prof. Andrea Mattevi. Il progetto di ricerca che ha portato alla stesura di questa tesi ha avuto lo scopo di descrivere dal punto di vista biochimico e strutturale la NADPH ossidasi 5 (NOX5). Le NADPH ossidasi (NOX) sono una famiglia di proteine integrali di membrana composte, nell'uomo, da sette membri (NOX1-5 e DUOX 1-2). La loro peculiare funzione enzimatica è dedicata esclusivamente alla generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), cosa che, data la recente rivalutazione della ROS Biology, le rende degli oggetti di studio estremamente interessanti. L’alterata regolazione dei livelli di ROS prodotte dalle NOX disturba infatti l'equilibrio dei processi di signaling cellulare di tipo redox, che spesso si inseriscono all’interfaccia tra i fenomeni fisiologici e quelli invece di natura patologica. Le NOX esplicano la propria funzione biologica trasferendo elettroni attraverso le membrane cellulari. A partire dall'ossidazione del substrato, il NADPH intracellulare, gli elettroni sono trasportati, uno alla volta, mediante un FAD e due gruppi eme, fino a una molecola di ossigeno extra-cellulare, l'accettore finale, che viene a sua volta ridotto a superossido. Il superossido è, di fatto, precursore di molte altre ROS. Tutte le NOX condividono il medesimo core catalitico, la struttura principalmente coinvolta nel trasferimento di elettroni, composto di un dominio C-terminale deidrogenasico (DH), contenente il sito di legame per il NADPH e una regione di legame per il FAD, e un dominio transmembrana (TM) composto da sei eliche altamente conservate. In quanto unico membro della famiglia NOX composto di una singola catena peptidica e che non necessiti di altre proteine per la propria attivazione, NOX5 è stata subito considerata un ottimo target ai fini della ricerca. Mentre la regolazione di NOX1-4 dipende principalmente, infatti, da proteine accessorie, NOX5 (e le DUOX) si affidano invece esclusivamente al proprio dominio N-terminale. Questo dominio N-terminale regolatorio, chiamato dominio EF per via dei suoi quattro motivi di legame al calcio comunemente noti come “EF-hands", è il principale fattore di attivazione di NOX5. Grazie agli esperimenti condotti nel corso del mio periodo di internato, dopo aver proceduto con l’espressione e la purificazione dei domini di interesse, alla fine del 2019 abbiamo quindi avuto modo di pubblicare alcuni rilevanti risultati riguardanti gli stati conformazionali del dominio EF (l’apo-stato privo di calcio e l'olo-stato provvisto di ioni calcio legati) attraverso analisi di HDX e NMR. Abbiamo inoltre anche cercato di chiarire e interpretare l’interazione, riportata in letteratura, dello stesso EF con il dominio DH mediante HDX. il ruolo di mediare questa interazione tra l’N-terminale e il C-terminale di NOX5 è stato identificato nel segmento chiamato REFBD (regulatory EF-hand-binding domain), ampiamente conservato anche tra i membri delle NOX sprovvisti di EF. A partire da queste premesse, abbiamo quindi sviluppato l'idea di eseguire esperimenti di mutagenesi sito-specifica della regione aminoacidica REFBD (D610-T633) e di una seconda regione della nostra proteina modello CsNOX5 (Cylindrospermum stagnale), nota come PhosR, anch’essa altamente conservata all’interno della famiglia delle NOX. L'ortologo cianobatterico CsNOX5 è stato preso a modello per via della significativa identità di sequenza (37%) con NOX5 umana, di cui mancano dati strutturali. Particolarmente rilevante nello studio è stata la scoperta di una proteina mutata caratterizzata da un'aumentata attività. Diversi protocolli di isolamento dei costrutti sono stati esplorati, e sono qui descritti, insieme alla caratterizzazione strutturale biochimica preliminare di NOX5.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/11622