Caratterizzazione biochimica e funzionale dell’enzima GLT25D1

Il collagene è la proteina fibrosa più abbondante presente nel corpo umano. E’ composto da una struttura a tripla elica costituita dall’unione di tre catene polipeptidiche, ed è principalmente localizzato a livello della matrice extracellulare dove conferisce elasticità e resistenza ai tessuti. La sintesi del collagene inizia all’interno del reticolo endoplasmatico ruvido, dove vengono sintetizzate le pro-catene α. I singoli monomeri delle pro-catene si assemblano tra di loro mediante legami ad idrogeno a formare la struttura a tripla elica costituita dai tipici motivi amminoacidici Gly-X-Y. Tali residui amminoacidici nel lume del RER subiscono una serie di modificazioni post-traduzionali necessarie per il corretto assemblamento della struttura a tripla elica del collagene. Le più importanti modificazioni post-traduzionali sono l’idrossilazione delle lisine e delle proline e la glicosilazione delle lisine e dei residui di idrossilisina. Tramite la via secretoria le triple eliche di collagene vengono portate all’esterno della cellula verso la matrice extracellulare, dove si associano in strutture superiori come fibre e fibrille. La glicosilazione delle idrossilisine del collagene è di grande importanza per il mantenimento della stabilità strutturale e avviene in due step: dapprima con l’attacco di un galattosio e successivamente con l’attacco di un glucosio a formare glucosil-galattosil-idrossilisina. La reazione di galattosilazione è catalizzata dalla famiglia enzimatica delle galattosiltransferasi, costituita da due enzimi GLT25D1 e GLT25D2. In questo lavoro di tesi ho caratterizzato da un punto di vista funzionale e biochimico l’enzima galattosiltransferasi 1 del procollagene (GLT25D1). Mediante un approccio in silico è stato determinato il grado di omologia di sequenza fra GLT25D1 e le altre due isoforme della famiglia. Il gene codificante per GLT25D1 è stato clonato, espresso e purificato ottenendo ottime rese. La proteina purificata è stata utilizzata per saggi di attività mediante l’utilizzo di un saggio in luminescenza. Infine, l’alta purezza della proteina ha anche permesso di impostare screening di cristallizzazione che hanno portato alla formazione di piccoli cristalli di proteina in corso di ottimizzazione al fine di risolvere la struttura tridimensionale dell’enzima.