Valutazione di nuovi inibitori della proteasi del virus Zika e di inibitori duali delle topoisomerasi di tipo II di E.Coli

Nel 2015 in Brasile si è registrato un picco anomalo nelle nascite di bambini affetti da microcefalia. Studi epidemiologici hanno confermato come questi casi siano da ricondurre ad una epidemia di virus Zika (ZIKV) allora in atto in quelle regioni. Da quel momento è cresciuto l’interesse della comunità scientifica nei confronti dell’infezione di questo virus. ZIKV è un arbovirus, isolato per la prima volta in Uganda in Macaco Rhesus nel 1947, ma fino al 2007 non si era verificata alcuna epidemia. Come altri arbovirus, ZIKV si trasmette principalmente attraverso il morso di zanzare del genere Aedes che fungono da ospite intermedio. Ad oggi non esistono né un vaccino né trattamenti efficaci contro. Lo sviluppo di farmaci antivirali è quindi prioritario per scongiurare il pericolo e gli effetti di nuove epidemie. La proteasi di ZIKV, formata da un complesso costituito dalla subunità proteasica della proteina NS3 e dalla proteina NS2B, ha un ruolo centrale nel ciclo vitale del virus. Questo enzima è responsabile del processamento della poliproteina virale, un passaggio cruciale per la maturazione delle proteine virali, e di conseguenza è identificato come un promettente bersaglio farmacologico. Lo scopo della prima parte di questa tesi sperimentale è quindi stato quello di valutare una libreria di composti identificati in silico come possibili inibitori della proteasi di ZIKV. A tal fine abbiamo trasformato cellule di E.Coli con un plasmide esprimente un costrutto in cui la subunità proteasica di NS3 è stata fusa direttamente con NS2B. L’espressione della proteina è stata quindi ottimizzata e la proteasi purificata tramite tecniche cromatografiche. L’attività enzimatica, e la potenza di inibizione dei diversi composti testati, è stata quindi valutata tramite saggi in vitro. Un problema via via sempre più rilevante nella pratica ospedaliera è dato dall’emergere con crescente frequenza di batteri patogeni resistenti a molteplici classi di antibiotici. Tra questi patogeni si annoverano i batteri conosciuti con l’acronimo ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp). Il Centro per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC) stima che patogeni ESKAPE resistenti agli antibiotici causino oltre 2 milioni di patologie e circa 23.000 morti all'anno. Di conseguenza, oltre all’attuazione di comportamenti virtuosi nell’uso di antibiotici e all’implementazione di protocolli ospedalieri che mitighino la diffusione di patogeni multiresistenti, è di prioritaria importanza lo sviluppo di nuovi antibiotici attivi contro le resistenze cliniche. Le topoisomerasi sono una classe di enzimi che i) rilassano la struttura del DNA in seguito alla torsione imposta durante trascrizione e replicazione, ii) consentono la segregazione di due copie identiche di interi genomi in due cellule figlie dopo la duplicazione e iii) intervengono nei meccanismi di compattazione del genoma, regolando i superavvolgimenti di senso positivo e negativo che caratterizzano l’organizzazione strutturale del DNA. In particolare, le topoisomerasi batteriche di tipo II comprendono la DNA girasi e la Topoisomerasi IV, che sono specifici degli organismi procariotici. Questi enzimi condividono un alto grado di omologia tra tutti i batteri e la soppressione contemporanea delle attività di entrambi risulta letale in tutti questi organismi. Di conseguenza, le topoisomerasi di tipo II rappresentano un bersaglio farmacologico estremamente attraente per lo sviluppo di nuovi antibiotici. La seconda parte di questa tesi sperimentale è incentrata sulla valutazione di una libreria di composti come possibili nuovi inibitori delle topoisomerasi di tipo II di E. Coli. Gli enzimi ricombinanti Girasi e Topoisomerasi IV di E. Coli sono stati acquistati e la potenza di inibizione dei diversi composti è stata valutata tramite saggi in vitro.