Caratterizzazione strutturale e funzionale del complesso Decaprenilfosforil-β-D-ribosio 2’- epimerasi (DprE1-DprE2)

From the latest TB report by the WHO, Tuberculosis (TB) is the infectious disease responsible for the highest number of deaths worldwide. It is estimated that 1/3 of the global population is currently affected. It represents an extremely worrying epidemiological threat to modern civilization, especially considering the recent appearance of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) strains resistant to more antibiotics currently part of the therapy and its co-morbidity and co-mortality with HIV infection and diabetes type II, both conditions being spread worldwide. For these reasons there is an urgent need to find new drugs and drug targets. In the last few years, the enzyme DprE1 expressed by Mtb has been categorized among the so-called promiscuous targets, given the possibility to inhibit it by means of chemicals having completely different scaffolds and binding sites. DprE1 is responsible, together with DprE2, for the biosynthesis of DPA, the sole donor of D-arabinofuranosyl residues for the synthesis of of arabinogalactan, which is the major component of the mycobacterial cell wall, which is essential for the survival of the pathogen. Currently there are several DprE1 inhibitors in preclinical and clinical trials, while DprE2 remains still to be structurally and functionally characterized and no inhibitors targeting it have been identified yet. It has been proposed that the two enzymes DprE1 and DprE2 interact forming a stable and functional heterodimeric complex. The overall purpose of this experimental work is the functional and structural characterization of the decaprenylphosphoryl-β-D-ribose epimerase as a key actor of the arabinogalactan biosynthesis. The first goal was to co-express DprE1 and DprE2 from M. tuberculosis and M. smegmatis in a E. coli platform, in order to subsequently evaluate by means of a multistep purification protocol the putative interaction between the two to form a functional complex. Indeed up to now any attempt to express and purify them separately, then mixed in vitro to observe a protein complex formation failed. This strategy is based on the hypothesis that DprE1 and DprE2 should undergo a translational co-folding to generate a functional complex in vivo. More molecular cloning and expression attempts have been performed and compared to fulfill this purpose. A second part of the work consists in the characterization of the mechanism of action (MoA) of avermetctins, a family of macrolides known for their anthelmintic activities, that have been found to be bactericidal against Mycobacterium tuberculosis. A phenotypic screen conduced in our lab suggested a role of DprE1, that was confirmed through enzymatic assay. Moreover, to understand the binding mode of these compounds an in silico approach was used. This approach identified some residues probably involved, and the role of these amino acids have been investigated through a site-directed mutagenesis study.

Dall’ultimo TB report redatto dalla Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), la tubercolosi (TB) è la malattia infettiva che causa il più alto numero annuo di morti al mondo. Si stima che un terzo della popolazione mondiale sia infetta in questo momento. Questa malattia rappresenta una tremenda minaccia epidemiologica nei confronti della società umana, specialmente tenendo in considerazione che recentemente sono stati isolati dei ceppi di Mycobacterium tuberculosis (Mtb) resistenti a più farmaci che attualmente sono parte della terapia per trattare gli infetti. Inoltre la malattia sembra mietere vittime in maniera ancora più preoccupante quando associata a co-infezione dal virus HIV o ad altre condizioni, come il diabete di tipo II, entrambe con una prevalenza rilevante su scala mondiale. Per queste ragioni, c’è un crescente bisogno di individuare nuovi farmaci e nuovi target molecolari. Negli ultimi anni, l’enzima DprE1 espresso da Mtb è stato definito un target promiscuo, dato che la sua attività enzimatica è inibita da svariati composti caratterizzati da uno scaffold molecolare differente e che legano diverse porzioni della proteina. DprE1 è uno degli enzimi che, insieme a DprE2, è coinvolto nella biosintesi del prodotto DPA, che nel metabolismo del micobatterio è l’unica fonte di residui di D-arabinofuranosil, necessari per la biosintesi dell’arabinogalattano, un componente fondamentale e peculiare della parete micolica, la quale è essenziale per la sopravvivenza del patogeno. Al momento ci sono diversi inibitori di DprE1 in fase preclinica e clinica, mentre DprE2 deve ancora essere caratterizzato a livello strutturale e funzionale. Nessun inibitore di DprE2 è al momento noto. Si pensa che i due enzimi interagiscano per formare un complesso eterodimerico stabile e funzionale. Il principale obiettivo di questo lavoro sperimentale è la caratterizzazione strutturale e funzionale dell’enzima decaprenilfosforil-β-D-ribosio epimerasi come attore fondamentale della biosintesi dell’arabinogalattano. La prima fase del progetto consiste nella co-espressione dei due enzimi DprE1 e DprE2 codificati da M. tuberculosis e da M. smegmatis sfruttando come piattaforma di espressione E. coli, con l’obiettivo di valutare, attraverso un protocollo di purificazione specifico e ottimizzato, la potenziale interazione fra i due a formare un complesso funzionale. Infatti fino ad ora qualsiasi tentativo di esprimere e purificare i due enzimi separatamente, per poi mescolarli in vitro per valutare la formazione di un complesso è fallito. Questa strategia si basa sull’ipotesi che DprE1 e DprE2 vadano incontro a un co-folding durante la loro traduzione in vivo. Più tentativi di clonaggio molecolare ed espressione sono stati testati e i loro risultati confrontati. Una seconda fase del lavoro consiste nella caratterizzazione del meccanismo d’azione delle avermectine, una famiglia di macrolidi nota per la loro attività antielmintica, che sembra essere anche battericida nei confronti di M. tuberculosis. Per mezzo di uno screen fenotipico condotto nel nostro laboratorio, è stato suggerito che DprE1 potesse essere coinvolto e ciò è stato confermato da saggi enzimatici. Inoltre, per determinare il meccanismo con il quale queste molecole si legano all’enzima, un approccio in silico è stato utilizzato, il quale ha premesso di individuare i residui probabilmente coinvolti: il ruolo di questi è stato investigato tramite uno studio di mutagenesi sito-diretta.