NOVA2 regola lo splicing alternativo di un regolatore trascrizionale e i livelli di mRNA nelle cellule endoteliali

The human genome comprises about 20.000-25.000 protein-coding genes, although the estimated human proteome size is of at least two orders of magnitude higher. One of the molecular mechanisms which can partially explain this apparent discrepancy is alternative splicing (AS): this is a post-transcriptional process which catalyzes the production of a set of discrete isoforms from the same primary transcript (pre-mRNA), ultimately allowing the synthesis of a number of proteins differing in function, localization and temporal expression. AS is implicated in a series of pathologies, ranging from genetic diseases to cancer. More precisely, aberrant AS has been characterized as one of cancer hallmarks. In the past, our laboratory research has focused on studying the role of the AS factor NOVA2, previously described only in central nervous system, during angiogenesis. We found that NOVA2 is expressed in endothelial cells (ECs) and involved in vascular development. Moreover, we found that NOVA2 is overexpressed in ovarian cancer vasculature with high NOVA2 expression associated with poor outcome in ovarian cancer patients. With the aim to further clarify NOVA2 role in vascular biology, we performed a RNA-seq of ECs lacking NOVA2 and control ECs, compiling a list of AS events and of differentially regulated genes (DEGs) between these two cell lines. Since NOVA2-regulated genes were enriched in transcription factors (TFs) and chromatin modulators, I investigated the possibility that NOVA2 could indirectly affect mRNA steady-state levels in ECs. I specifically focused on one NOVA2-mediated AS event in E2F1 dimerization partner Tfdp2. I found that NOVA2 promoted the production of a Tfdp2 isoform containing exon 7 (Tfdp2-FL), featuring a nuclear localization signal (NLS); instead, NOVA2 depleted ECs were characterized by the presence of the Tfdp2-Δ7 protein without exon 7. The lack of a NLS in Tfdp2-Δ7, but not in Tfdp2FL, prompted us to hypothesize that the full-length protein accumulates more in nucleus than Tfdp2Δ7. In this view, I generated two plasmids encoding for GFP-tagged Tfdp2-FL and Tfdp2-Δ7 and used them to transiently transfect HeLa cells. Through this analysis I demonstrated that Tfdp2-FL protein effectively accumulated in the nucleus, whereas Tfdp2-Δ7 (deleted of the NLS) localized in both nucleus and cytoplasm. Importantly, a large percentage of the DEGs upon NOVA2 depletion were targets of E2F1, a transcriptional regulator that dimerizes with Tfdp2. Interestingly, E2F1 target genes featured in our DEGs were enriched for genes involved in vasculature development and angiogenesis. Finally, I found that higher Tfdp2-FL nuclear localization was associated with increased interaction with E2F1 and, as a consequence, enhanced expression of E2F1 target genes (such as Dll4). Collectively, my results provide an additional level of complexity to the sequential series of events (such as that implicated in AS regulation) controlled by NOVA2 in ECs in order to orchestrate vascular biology.

Il genoma umano comprende all’incirca 20.000-25.000 geni che codificano per proteine, sebbene recenti stime indichino che la dimensione del proteoma sia più grande di almeno due ordini di grandezza. Uno dei meccanismi molecolari che possono spiegare almeno in parte questa apparente asimmetria è lo splicing alternativo (SA): si tratta di un processo post-trascrizionale che catalizza la formazione di isoforme distinte a partire dal medesimo trascritto primario (pre-mRNA), determinando quindi la sintesi di un grande numero di proteine che si distinguono per funzione, localizzazione ed espressione. Lo SA è implicato in una serie di patologie che spaziano dalle malattie genetiche al cancro. Nello specifico, lo SA è uno degli hallmarks tumorali. La nostra ricerca di laboratorio degli ultimi anni si è concentrata sullo studio del ruolo del fattore di splicing NOVA2, precedentemente descritto solo a livello del sistema nervoso centrale, nel processo di angiogenesi. Abbiamo scoperto che NOVA2 è espresso a livello delle cellule endoteliali ed è coinvolto nello sviluppo vascolare. Inoltre, abbiamo scoperto che NOVA2 è sovraespresso nel sistema vascolare del carcinoma ovarico, e che gli elevati livelli di espressione di NOVA2 sono associati a prognosi scarsa nei pazienti affetti da cancro dell’ovaio. Con l’intento di comprendere ulteriormente il ruolo di NOVA2 nella biologia vascolare, abbiamo eseguito un RNA-seq su cellule endoteliali private di NOVA2 e cellule di controllo, comparando i risultati e stilando un elenco di eventi di SA e di geni espressi differentemente (differentially expressed genes, DEGs) tra queste due linee cellulari. Tra geni regolati da NOVA2 è stato riscontrato un arricchimento in geni codificanti fattori di trascrizione e rimodellatori della cromatina: per questo ho indagato sulla possibilità che NOVA2 possa influenzare indirettamente i livelli di mRNA nelle cellule endoteliali. Ho diretto la mia attenzione su uno degli eventi di SA indotto da NOVA2 nel partner di dimerizzazione di E2F1, Tfdp2. Ho scoperto che NOVA2 promuove la produzione di una isoforma di Tfdp2 che include l’esone 7 (Tfdp2-FL), comprendente un segnale di localizzazione nucleare (nuclear localization signal, NLS); invece, le cellule private di NOVA2 sono caratterizzate dalla presenza della isoforma Tfdp2-Δ7, mancante dell’esone 7. La mancanza del NLS in Tfdp2-Δ7, ma non in Tfdp2-FL, ci ha indotto a ipotizzare che la proteina full-length viene accumulata maggiormente nel nucleo rispetto a Tfdp2-Δ7. In quest’ottica, ho generato due plasmidi codificanti per Tfdp2-FL e Tfdp2-Δ7 marcati con GFP, e li ho usati per trasfettare transientemente cellule HeLa. Attraverso questa analisi ho dimostrato che la proteina Tfdp2-FL viene accumulata efficacemente nel nucleo, mentre la proteina Tfdp2-Δ7, mancante il NLS, è localizzata sia nel nucleo che nel citoplasma. Inoltre, una grande porzione dei DEGs nelle cellule private di NOVA2 sono dei target di E2F1, un regolatore trascrizionale che dimerizza con Tfdp2. È interessante notare che la lista di target di E2F1 compresi nei DEGs è arricchita in geni coinvolti nello sviluppo della vascolatura e nella angiogenesi. Infine, ho scoperto che la maggiore localizzazione di Tfdp2-FL a livello nucleare è associata ad una maggiore interazione con E2F1 e di conseguenza ad una aumentata espressione dei target di E2F1 come Dll4. In conclusione, i risultati che ho ottenuto contribuiscono a chiarire un aspetto della complessità insita nella serie di eventi (tra cui quelli coinvolti nella regolazione dello SA) controllati da NOVA2 nelle cellule endoteliali al fine di regolare la biologia vascolare.