Imaging con spettrometria di massa MALDI della follicologenesi ovarica di topo

In the female reproductive system, the mammalian ovary is a highly dynamic organ that undergoes a continuous, but still poorly understood, tissue remodelling. The female gonad is responsible for the production of female gametes, of steroid hormones, and it contributes to create the necessary conditions for the development and nourishment of the embryo once implanted on the uterine wall. The follicle is the ovarian fundamental functional unit, a crosstalk between the follicular and the oocyte components contributes to the correct follicle growth and the acquisition of the oocyte developmental competence. The purpose of my thesis project was to identify in-situ, through the use of the MALDI Mass Spectrometry Imaging (MALDI-MSI) analysis and Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (LC-ESI-MS/MS), the peptide content of each growing follicle type, allowing to distinguish the main molecular changes and the activation of specific pathways occurring during folliculogenesis. MALDI-MSI is an emerging and powerful technique that combines Mass Spectrometry with histology, thus allowing the in-situ and label-free detection of thousands of analytes maintaining their localisation in the tissue architecture. MALDI-MSI has never been used before for the analysis of the mammalian ovary. First, the use of LC-ESI-MS/MS allowed the identification of 382 mouse proteins, 75 of which have a crucial role in the biology of the ovary, specifically in follicle growth, oocyte maturation, ovulation, oocyte quality, fertilisation, luteolysis, angiogenesis and ovary pathologies. Then, using Principal Component Analysis (PCA) on MALDI-MSI data, the mass spectra of each follicular class were compared to the mass spectrum obtained grouping together all the classes. This analysis showed a clusterisation of data in a specific region of the 3D PCA plot. Although not significative (p>0,005), this result suggests a shift in the spectra localisation from pre-antral (T5) to pre-ovulatory (T8) follicles. Subsequently, PCA was done comparing the mass spectra of each single follicle to those of its entire follicle class. This analysis brought up a significative separation of the of T8 mass spectra into two separate clusters. Receiver Operating Characteristic (ROC) analysis of T8.1 vs. T8.4, the two most significantly separated T8 follicles in PCA, highlighted the presence of 45 proteins differentially expressed, 9 of which are well known to be involved in key ovarian functions. In conclusion, this study is the first to use MALDI-MSI on the mammalian ovary and has enabled the identification of the peptide content of each follicle type growing inside the gonad. The knowledge of the peptide content is essential to understand the biological events occurring in the organ and identify new molecular biomarkers.

Nel sistema riproduttivo femminile, l’ovario di mammifero è un organo altamente dinamico soggetto a continuo, ma ancora poco compreso, rimodellamento tissutale. La gonade femminile è responsabile della produzione dei gameti femminili, degli ormoni steroidei e contribuisce alla realizzazione delle condizioni necessarie per lo sviluppo e il sostentamento dell’embrione dopo il suo impianto sulla parete dell’utero. Il follicolo è l’unità funzionale fondamentale dell’ovario e un continuo scambio di informazioni tra le componenti follicolare e dell’oocita contribuisce alla corretta crescita dell’intero follicolo e all’acquisizione della competenza allo sviluppo dell’oocita. L’obiettivo del mio progetto di tesi è stato quello di identificare in-situ, attraverso l’uso della MALDI Spettrometria di Massa Imaging (MALDI-MSI) analisi e della Cromatografia Liquida a Ionizzazione per Elettrospray abbinata a Spettrometria di Massa Tandem (LC-ESI-MS/MS), il contenuto peptidico di ogni tipologia follicolare, permettendo di distinguere i principali cambiamenti molecolari e l’attivazione di specifiche vie di segnalazione durante la follicologenesi. MALDI-MSI è una tecnica nuova che combina la Spettrometria di Massa con l’analisi istologica, consentendo quindi la rilevazione in-situ di migliaia di analiti non marcati e, allo stesso tempo, mantenendo la loro localizzazione nell’architettura tissutale. Inizialmente, la tecnica LC-ESI-MS/MS ha permesso di identificare 382 proteine, 75 delle quali hanno un ruolo cruciale nella biologia dell’ovario, nello specifico nella crescita follicolare, maturazione dell’oocita, ovulazione, qualità dell’oocita, fecondazione, lisi del corpo luteo, angiogenesi e patologie dell’ovario. In seguito, usando la Principal Component Analysis (PCA) sui dati ottenuti con MALDI-MSI, gli spettri di massa di ogni classe follicolare sono stati comparati con gli spettri di massa ottenuti raggruppando insieme tutte le classi. Questa analisi ha rivelato un raggruppamento dei dati in una regione specifica del grafico 3D della PCA. Sebbene queste differenze non siano risultate significative (p > 0,005), suggeriscono uno spostamento nella localizzazione degli spettri dal follicolo pre-antrale (T5) a quello pre-ovulatorio (T8). Successivamente, la PCA è stata eseguita comparando gli spettri di massa di ogni singolo follicolo con quelli dell’intera classe follicolare. In questo caso, in particolare gli spettri di massa dei follicoli T8 sono risultati significativamente separati in due gruppi. La Receiver Operating Characteristic (ROC) analisi di T8.1 vs. T8.4, i due follicoli T8 maggiormente separati nella PCA, ha evidenziato la presenza di 45 proteine differenzialmente espresse, per 9 delle quali è noto il coinvolgimento in funzioni chiave dell’ovario. In conclusione, questo studio è il primo ad utilizzare la tecnica di MALDI-MSI sull’ovario di mammifero e ha permesso l’identificazione del contenuto peptidico di ogni tipologia follicolare presente nella gonade femminile. La comprensione del contenuto peptidico è essenziale per conoscere gli eventi biologici che avvengono nell’organo e identificare nuovi marcatori molecolari.