3D imaging del testicolo di topo adulto: ottimizzazione di una metodologia di clearing ottico

La necessità di svincolarsi da uno studio del campione derivante dalla disgregazione di tessuti e cellule per comprenderne il corretto funzionamento, ha portato, negli ultimi anni, molti studiosi ad elaborare strategie di studio che garantissero il mantenimento di un'organizzazione tridimensionale (3D) del campione. Gli approcci e gli strumenti che si stanno utilizzando sono molteplici e ancora in fase di elaborazione e di ottimizzazione. Una tecnica che sicuramente ha destato molto interesse in questo senso è lo sviluppo del clearing ottico di diversi organi, finalizzato allo studio della struttura tridimensionale degli stessi. Tuttavia, ad oggi, pochi studi hanno garantito di ottenere risultati apprezzabili sul testicolo di mammifero adulto, complice anche una particolare complessità del tessuto, caratterizzato da una densità cellulare consistente e da numerose giunzioni cellulari. Obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di ottimizzare sul testicolo di topo adulto una metodologia di clearing ottico partendo da quelle già presenti in letteratura e applicate ad altri organi. L’esperienza maturata nel corso degli anni sulla gonade maschile e la recente introduzione della tecnica del clearing per lo studio della gonade femminile, ha portato il team del Laboratorio di Biologia dello Sviluppo a puntare sulla tecnica iDISCO (Immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs) in quanto si tratta di una procedura semplice, che non richiede attrezzature speciali e che può essere combinata con l’immunolabeling e quindi per uno studio molecolare delle cellule di tessuto di interesse. La procedura si è focalizzata sulla messa in evidanza della componente nucleare mendiante colorazioni molecole fluorescenti specifiche per la cromatina e l’identificazione della componente germinale in prima profase meiotica mediante l’utilizzo di un anticorpo specifico per la proteina 3 del complesso sinaptonemale (SYCP3), che permette l’identificazione specifica degli spermatociti primari. Per ottimizzare il protocollo ci si è concentrati sul migliorare reagenti utilizzati e tempistiche di svolgimento dei singoli passaggi. ciò ha portato ad ottenere un buon risultato di trasparenza dell’organo e di penetrazione del DAPI, ma la penetrazione degli anticorpi non è andata oltre la porzione superficiale del testicolo evidenziando la possibilità del raggiungimento del limite massimo raggiungibile con questa tecnica. Ricerche future potrebbero essere rivolte all’utilizzo di testicoli di topi più giovani o all’utilizzo di altre metodologie di clearing.