Generation and characterization of a murine model with a conditional inactivation of Tmem38b in the bone tissue: a new tool to study Osteogenesis Imperfecta type XIV

Osteogenesis Imperfecta (OI), or brittle bone disease, is a rare disorder that comprehends a phenotypically and molecularly heterogeneous group of inherited connective tissue diseases sharing similar skeletal abnormalities, bone fragility and deformity. Mutations in the TMEM38B gene cause the autosomal recessive OI type XIV (OMIM #615066). This gene encodes for the trimeric intracellular cation channel B (TRIC-B) on rER membrane, a monovalent cation-specific channel for K+ ions that is necessary for intracellular calcium flux. Defective ER calcium flux dysregulates collagen synthesis, likely by impairing multiple rER enzymes. To examine the role of the TRIC-B channel, a global knock-out murine model for Tmem38b was generated but resulted in a lethal phenotype because of respiratory failure. In order to evaluate the TRIC-B function specifically in the bone tissue, a bone specific conditional knock-out of Tmem38b (Runx2Cre;Tmem38bfl/fl) was generated with a gene targeting approach. In particular, the Cre/loxP system was used to remove the exon 3 of the Tmem38b gene under the bone specific Runx2 promoter. The absence of TRIC-B in the bone tissue of the conditional knock-out was confirmed at the molecular level by PCR and sequencing and by western blot analysis, at the protein level. Since OI is characterized by reduced grow, a growth curve analysis was performed revealing a grow delay in mutant mice. Moreover, x-ray analysis by Faxitron of P28 Runx2Cre;Tmem38bfl/fl mice showed bone calli in the long bones, indicating the presence of fractures. Skeletal staining with alizarin red, specific for bone, and alcian blue, specific for cartilage, confirmed the presence of calli even at the level of the ribs. The tibia 3D reconstruction by micro computed tomography revealed a different shape between control and mutant bone and a smaller tibia in the mutant. Both bone cortical and trabecular compartment were analysed with micro computed tomography, revealing a significative impairment in most of the geometrical properties, thus indicating the presence of an osteoporotic phenotype. In conclusion, the Runx2Cre;Tmem38bfl/fl mouse represents a valid model of OI type XIV that will allow to study the TRIC-B role in calcium homeostasis.

L'osteogenesi imperfetta (OI) è una malattia genetica rara che comprende un gruppo fenotipicamente e molecolarmente eterogeneo di malattie ereditarie del tessuto connettivo che condividono anomalie scheletriche simili, fragilità ossea e deformità. Mutazioni nel gene TMEM38B causano l’OI di tipo XIV, con ereditarietà autosomica recessiva (OMIM #615066). Questo gene codifica per il TRrimeric Intracellular Cation channel B (TRIC-B), un canale presente sulla membrana del reticolo endoplasmatico rugoso (RER) specifico per gli ioni K+ e con un ruolo nel flusso di calcio intracellulare. Un difettoso flusso di calcio nel RER inficia la sintesi del collagene, probabilmente attraverso la compromissione di diversi enzimi presenti nel RER. Per esaminare il ruolo del canale TRIC-B, è stato generato un modello murino knock-out globale per Tmem38b, il cui fenotipo è risultato letale a causa di insufficienza respiratoria. Al fine di valutare la funzione TRIC-B specificamente nel tessuto osseo, è stato quindi generato un knock-out condizionale di Tmem38b specifico nell’osso (Runx2Cre; Tmem38bfl/fl) con un approccio di targeting genetico. In particolare, per rimuovere l’esone 3 del gene Tmem38b è stato utilizzato il sistema Cre/loxP sotto Runx2, promotore specifico dell’osso. L'assenza di TRIC-B nel tessuto osseo del knock-out condizionale è stata confermata a livello molecolare mediante PCR e sequenziamento ed a livello proteico mediante western blot. Poiché l'OI è caratterizzata da una ridotta crescita, è stata condotta un'analisi della curva di crescita che rivela un ritardo nei topi mutanti. Inoltre, l'analisi ai raggi X di topi Runx2Cre; Tmem38bfl/fl a P28 ha mostrato calli ossei nelle ossa lunghe, indicando la presenza di fratture. La colorazione dello scheletro con rosso di alizarina, specifico per l'osso, ed alcian blue, specifico per la cartilagine, ha confermato la presenza di calli anche a livello delle costole. La ricostruzione 3D della tibia mediante micro-tomografia computerizzata ha rivelato una diversa morfologia tra l’osso del topo controllo e quello del mutato, che è risultato più piccolo. Inoltre, sempre con la micro-tomografia computerizzata sono stati analizzati sia il compartimento osseo corticale che quello trabecolare, rivelando una significativa differenza nella maggior parte delle proprietà geometriche ed indicando così la presenza di un fenotipo osteoporotico. In conclusione, il topo Runx2Cre;Tmem38bfl/fl rappresenta un valido modello di OI tipo XIV che permetterà di studiare il ruolo del TRIC-B nell'omeostasi del calcio.