The inactivation of the Spt2 elongation factor suppresses R-loop accumulation during head-on replication-transcription conflicts in budding yeast sen1 mutants. (L’inattivazione del fattore di allungamento Spt2 sopprime l’accumulo di R-loops nei conflitti frontali tra replicazione e trascrizione in cellule di lievito mutate in SEN1)

DNA replication and transcription are two fundamental cellular processes that share the same DNA template, thus inevitably interfering with each other. DNA transcription acts as an obstacle to fork progression, leading to replication stress and genome instability which are hallmarks of oncogenesis and neurodegeneration. Head-on replication-transcription conflicts are particularly detrimental for genome stability as they stabilize R-loops, which are highly recombinogenic and mutagenic structures formed by a RNA:DNA hybrid duplex and a displaced single stranded DNA. The budding yeast RNA/DNA helicase Sen1, the ortholog of human Senataxin, which is implicated in cancer and neurodegeneration, associates with the replication fork and displaces R-loops at highly transcribed RNA Polymerase II (RNAPII) genes, thus preventing fork arrest at sites of head-on replication-transcription collisions. In our laboratory we highlighted the dangerous nature of head-on collisions between replication and transcription and their detrimental outcome on fork progression. We have recently demonstrated that, in sen1 mutant cells, RNAPII together with R-loops contributes to the transcription-dependent fork barrier. The attenuation of RNAPII processivity through the inactivation of RNAPII elongation factors, among which the HMG-like factor Spt2, allows fork progression across the transcriptional barrier. In this thesis work, using DRIP-qPCR technique and setting up an Immunofluorescence protocol on yeast chromosome spreads, we explored the effects of SPT2 inactivation on R-loop accumulation. We showed that SPT2 inactivation suppresses genome-wide accumulation of RNA:DNA hybrids and those generated upon head-on replication-transcription conflicts in sen1 mutants. These data, together with previous findings obtained in our laboratory, demonstrated that an RNAPII entering in the proficient elongation phase of transcription promotes R-loop formation and is a major obstacle to fork progression and genome stability in sen1 mutants. Here we have also found that SPT2 inactivation did not rescue RNA:DNA hybrid accumulation and replication stress in cells lacking RNase H proteins, another class of enzymes involved in RNA:DNA hybrid clearance. We propose that, while Sen1 counteracts R-loop accumulation during head-on replication-transcription collision, RNase H proteins may act at a different temporal window of the cell cycle, most likely in a post-replicative phase.

La replicazione e la trascrizione del DNA sono due processi cellulari fondamentali che condividono lo stesso substrato di DNA, ed inevitabilmente interferiscono fra loro. La trascrizione del DNA agisce come un ostacolo per la progressione della forcella replicativa portando all’insorgenza dello stress replicativo e all'instabilità del genoma, entrambi segni distintivi dell'oncogenesi e delle malattie neurodegenerative. In particolare, i conflitti frontali tra replicazione e trascrizione sono particolarmente dannosi per la stabilità del genoma in quanto promuovono la stabilizzazione degli R-loop, ovvero pericolose strutture ricombinogeniche e mutageniche formate da tre filamenti di acidi nucleici: un ibrido RNA:DNA e un singolo filamento di DNA. L’RNA/DNA elicasi del lievito Saccharomyces cerevisiae Sen1, ortologa dell’umana Senataxina, implicata nel cancro e nella neurodegenerazione, si associa alla forcella replicativa e previene l’accumulo degli R-loops formati a livello dei geni altamente trascritti della RNA Polimerasi II (RNAPII), prevenendo dunque l’arresto della forca ai siti dei conflitti frontali tra replicazione e trascrizione. Nel nostro laboratorio abbiamo evidenziato come gli scontri frontali tra replicazione e trascrizione risultino particolarmente dannosi per la stabilità del genoma in quanto sono in grado di arrestare la progressione della forcella replicativa. Abbiamo recentemente dimostrato come, nelle cellule mutate in Sen1, l’RNAPII e gli R-loop rappresentano una barriera impenetrabile per la progressione della forcella replicativa. L’attenuazione della processività della RNAPII mediante l’inattivazione dei fattori di allungamento della RNAPII, tra i quali il fattore Spt2 con attività simile alle proteine HMG umane, permette la progressione della forcella replicativa attraverso la barriera trascrizionale. In questo lavoro di tesi, usando la tecnica di DRIP-qPCR e mettendo a punto un protocollo per l’Immunofluorescenza su cromatina decondensata, abbiamo analizzato gli effetti dell’inattivazione di SPT2 sull'accumulo degli R-loop. Abbiamo messo in evidenza come l’inattivazione di SPT2 previene l’accumulo genome-wide degli R-loops dovuto agli scontri frontali tra replicazione e trascrizione nelle cellule mutate in Sen1. I nostri risultati, insieme a dati precedenti ottenuti, dimostrano come l’RNAPII in grado di entrare in modo efficiente la fase di allungamento della trascrizione rappresenta uno dei maggiori ostacoli per la progressione della forcella replicativa, promuovendo la formazione degli R-loop e rappresentando una minaccia per la stabilità del genoma nei mutanti di Sen1. Inoltre, abbiamo evidenziato come l’inattivazione di SPT2 non previene l’accumulo degli R-loop e l’insorgenza dello stress replicativo in cellule nelle quali l’attività degli enzimi RNasi H, fattori coinvolti nella risoluzione degli ibridi RNA:DNA, è compromessa. In conclusione, i nostri dati suggeriscono come l’elicasi Sen1 sia in grado di contrastare l’accumulo degli R-loops a seguito degli scontri frontali tra replicazione e trascrizione, in questo contesto gli enzimi RNasi H agiscono in una diversa finestra temporale del ciclo cellulare, probabilmente in fase post-replicativa.