Several studies suggest that homeostatic responses through gene regulation were mediated by cellular transcriptional machinery and its chromatin-associated proteins, following environment inputs; this lead cells to adapt to environmental changes. The aim of this study is to investigate chromatin status under stressing conditions, with particular regard to nutritional stress. Chromatin exists in two forms, euchromatin and heterochromatin. Euchromatin is less condensed and can be transcribed, while heterochromatin refers to the condensed form of chromatin. Some heterochromatin is associated with nuclear lamina and is usually called Lamina associated-domains (LADs), whereas heterochromatin associated with nucleoli is usually referred as Nucleolus associated-domains (NADs). We investigated epigenetic modification characterizing LADs and NADs in mouse hepatocytes and their changes under nutritional stress. The transcriptional status was then analyzed with particular focus on nucleolus, responsiveness to perturbation of cell homeostasis.
Le cellule tendono a rispondere in maniera adattativa alle variazioni del loro ambiente esterno. Comprendere, dunque, in che modo le cellule si adattino all’ambiente risulta di fondamentale importanza. Numerosi studi suggeriscono che risposte omeostatiche attraverso la regolazione genica sono mediate dal macchinario trascrizionale e dalle proteine associate alla cromatina. Le variazioni dello stato cromatinico sono state studiate in condizioni di stress, con particolare riguardo alle variazioni associate a restrizione calorica. La cromatina esiste in due stati: eucromatina ed eterocromatina. Sono state studiate le modificazioni epigenetiche caratterizzanti domini associati alla lamina (lamina-associated domains, LADs) e domini associati al nucleolo (nucleolus-associated domains, NADs) negli epatociti di topo. È stata poi analizzata l’attività del nucleolo in quanto, essendo il sito nel quale avviene la trascrizione dell’RNA ribosomiale, ricopre un ruolo fondamentale nel metabolismo cellulare. Le modificazioni epigenetiche e la sintesi di rRNA sono state analizzate in epatociti sottoposti ad una parziale deplezione di siero fetale bovino (0,1 % per 96 h) rispetto al gruppo di controllo (10%). Il siero fetale bovino contiene nutrienti essenziali, fattori di crescita e ormoni che sostengono la crescita e la proliferazione cellulare; pertanto una restrizione calorica induce un leggero stress cellulare. Parallelamente, un altro gruppo di epatociti è stato sottoposto ad un supplemento di desametasone (1 µM) rispetto al controllo. Il desametasone è un potente glucocorticoide di sintesi, appartenente alla classe degli antinfiammatori steroidei; i glucocorticoidi giocano un ruolo importante nella risposta allo stress aumentando la resistenza dell’organismo. Gli effetti di questi due trattamenti sono stati valutati principalmente mediante tecniche di immunocitochimica al microscopio elettronico e al microscopio a fluorescenza. Al microscopio elettronico è stata analizzata la distribuzione di modifiche istoniche associate a repressione trascrizionale, quali H3K27me3 e H4K20me3; a seguire è stata analizzata la distribuzione di fibrillarina, enzima coinvolto nell’elaborazione dell’RNA pre-ribosomiale e presente dunque nel nucleolo. Dai risultati ottenuti è stato riscontrato un complessivo aumento di modificazioni istoniche repressive negli epatociti sottoposti a restrizione calorica; mentre la distribuzione della fibrillarina risulta maggiore negli epatociti sottoposti ad un supplemento di desametasone. Per visualizzare le aree di eterocromatina è stata effettuata una colorazione con Hoechst 33258. La marcatura con Bromouridina, derivato dell’uridina con un sostituente bromo al quinto carbonio, è stata effettuata per analizzare la sintesi di RNA ribosomiale. I dati raccolti suggeriscono maggiori aree eterocromatiniche nelle cellule sottoposte a restrizione calorica, accompagnate da una riduzione della sintesi di rRNA; non è stata invece riscontrata una maggiore sintesi di rRNA negli epatociti sottoposti a supplemento di desametasone. Lo stato cromatinico è stato studiato in condizioni di stress al fine di comprendere ulteriormente la risposta trascrizionale omeostatica delle cellule. La maggior parte degli enzimi che modificano la cromatina utilizzano i prodotti intermedi del metabolismo come cofattori o substrati, pertanto questi enzimi rilevano questi prodotti intermedi del metabolismo e trasformano queste informazioni in modificazioni post traslazionali (PTMs) della cromatina. Lo studio dell’impatto del metabolismo sull’espressione genica legata all’epigenetica si pone come obiettivo una comprensione più integrata del funzionamento cellulare, dell’omeostasi dei tessuti, dell’invecchiamento e delle malattie.
Caratterizzazione ultrastrutturale dello stato della cromatina in condizioni di stress
MANZOLILLO, ANNAMARIA
2019/2020
Abstract
Several studies suggest that homeostatic responses through gene regulation were mediated by cellular transcriptional machinery and its chromatin-associated proteins, following environment inputs; this lead cells to adapt to environmental changes. The aim of this study is to investigate chromatin status under stressing conditions, with particular regard to nutritional stress. Chromatin exists in two forms, euchromatin and heterochromatin. Euchromatin is less condensed and can be transcribed, while heterochromatin refers to the condensed form of chromatin. Some heterochromatin is associated with nuclear lamina and is usually called Lamina associated-domains (LADs), whereas heterochromatin associated with nucleoli is usually referred as Nucleolus associated-domains (NADs). We investigated epigenetic modification characterizing LADs and NADs in mouse hepatocytes and their changes under nutritional stress. The transcriptional status was then analyzed with particular focus on nucleolus, responsiveness to perturbation of cell homeostasis.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/11981