'Caratterizzazione strutturale e biochimica della monossigenasi flavina-dipendente di tipo 1 ancestrale

Flavin-containing monooxygenases (FMOs) are a family of enzymes specialized in the oxidation of xenobiotics in order to facilitate their excretion, degradation and lower their toxicity. They require NADPH as a cofactor and FAD as a prosthetic group to function. For many years, structural information depicting these enzymes was absent in the literature. The goal of this research was to expand our knowledge on this family by scrutinizing mammalian ancestral flavin-containing monooxygenase 1, AncFMO1, through the determination of its crystal structure in order to elucidate its structure-function properties and substrate scope, using Ancestral Sequence Reconstruction (ASR) as a thermostable enhancement tool. Previously in our laboratory, using the same approach, three mammalian ancestors of the five FMOs, FMO2, FMO3-6 and FMO5 were structurally resolved. This work was the basis for finding the conditions for expression, purification and crystallization conditions for AncFMO1. We were able to successfully express and purify AncFMO1 in Escherichia coli and utilize Histidine and SUMO tags, respectively. Remarkably, we obtained protein crystals and the enzyme was shown to be active. Furthermore, the structure was determined by x-ray diffraction to a resolution of 3.0 Å. For the first time, the structure of a mammalian membrane-bound FMO1 was obtained. It portrays features shown to be very similar to the other studied AncFMOs including a well conserved paired Rossmann fold and membrane binding mode. Moreover, it depicts new features unique to this isoform including an enlarged solvent exposed active site cavity and an unprecedented coenzyme binding mode. In addition, AncFMO1 has a very high sequence identity (89%) with its human descent, therefore, it can be considered as a good model for rational structure-based drug design and enzymatic essays in pharmaceutical studies.

Le monossigenasi flavina-dipendenti (FMOs) rappresentano enzimi di grande rilevanza nel processo di ossidazione di xenobiotici volto a promuoverne l’escrezione, la degradazione e l’abbassamento del livello di tossicità. Il funzionamento delle FMOs richiede il NADPH come cofattore e il FAD come gruppo prostetico. Nonostante l’importanza di questi enzimi, per molti anni in letteratura non sono stati evidenziati dati che li caratterizzassero dal punto di vista strutturale. Lo scopo del progetto di ricerca è stato quello di investigare, soprattutto a livello strutturale, questo gruppo di enzimi; specificatamente, questo progetto di tesi si è focalizzato su un enzima in particolare: la monoossigenasi flavina-dipendente di tipo 1 ancestrale di mammifero (AncFMO1). La determinazione della struttura cristallografica di questo enzima ha permesso di poter capire il rapporto struttura-funzione e di investigare il legame con il substrato. La caratterizzazione strutturale è stata resa possibile dall’utilizzo di una tecnica di Ricostruzione Ancestrale di Sequenze come strumento di miglioramento della termostabilità dell’enzima. Nell’ambito dell’ attività di ricerca del nostro laboratorio questa tecnica era già stata precedentemente utilizzata per risolvere la struttura di tre proteine ancestrali di mammifero delle cinque FMOs esistenti: FMO2, FMO3-6 e FMO5. Il lavoro condotto su questi enzimi ha gettato le basi per determinare le condizioni di espressione, purificazione e cristallizzazione che poi sono state successivamente utilizzate anche per AncFMO1. L’espressione di AncFMO1 è stata ottenuta in E.coli e la sua purificazione si è basata sulla presenza di un tag (sistema Istidina-Sumo proteasi): in entrambi i casi i risultati ottenuti sono stati soddisfacenti e hanno permesso di ottenere un enzima attivo e cristallizzabile. I cristalli ottenuti hanno portato alla risoluzione della struttura cristallografica della proteina a 3.0 A di risoluzione sfruttando la diffrazione dei raggi X. La struttura ottenuta rappresenta la prima caratterizzazione strutturale di questo enzima. Analizzandone le caratteristiche, è evidente che essa mostri numerose similitudini con le altre strutture di AncFMOs già caratterizzate; in particolare è presente un motivo strutturale definito ‘’Rossman Fold’’ e un dominio strutturale di membrana. Nonostante queste analogie con gli altri AncFMOs, AncFMO1 presenta alcune caratteristiche strutturali che si sono rivelate specifiche di questa isoforma tra cui un sito attivo particolarmente esposto al solvente e un differente modo di legare il cofattore. Inoltre, AncFMO1 mostra un’ elevata identità di sequenza (89%) con l’enzima umano e per questo motivo può essere considerato come un eccellente modello per effettuare un ‘’drug-design’’ basato sulla struttura dell’enzima e saggi enzimatici in ambito farmaceutico.