Modelli zebrafish di malattie scheletriche per lo studio della formazione ossea e per lo screening farmacologico

Introduction Osteogenesis imperfecta (OI) is a heritable bone disorder characterized by growth deficiency, skeletal deformity and fragility. OI was traditionally known as a disease caused by dominant mutations in COL1A1 and COL1A2 genes, coding for the α1 and α2 chains of collagen type I. OI type III is the most severe non-lethal form of dominant OI. Patients are wheel-chaired and show multiple fractures and progressive skeletal deformities. Recently, recessive mutations in genes encoding for proteins involved in collagen biosynthesis, maturation and folding have been identified. Among them, OI type VIII is characterized by severe osteochondrodysplasia, undertubulated long bones and fragile ribs. It is caused by mutations in P3H1 encoding the prolyl 3-hydroxylase 1, member of the endoplasmic reticulum resident prolyl 3-hydroxilation complex, which is involved in collagen folding. Among animal models for skeletal disorders, the embryos transparency and the conserved ossification processes and gene expression profiles with mammals, make zebrafish an appealing tool to study bone diseases, such as OI. During my master thesis I used the dominant OI zebrafish model Chihuahua (Chi/+), carrying a glycine substitution in the α1 chain of collagen type I and the recessive OI zebrafish models p3h1 knock out ( p3h1-/-) to underpin the effect of the disease on bone formation and to test anabolic and anti-catabolic pharmacological approaches. Results In tail regeneration experiments, performed on 3 and 8 months old fish, an impaired bone formation was observed in p3h1-/- at both ages and in younger Chi/+ respect to WT. The chemical chaperone 4-phenylbutyrate (4-PBA), administred during the caudal fin regeneration process, improved the newly formed bone only in p3h1-/- mutants. No difference in early osteoblastogenesis was detected by gene expression analysis on regenerated caudal fins of p3h1-/- compared to WT. On the contrary, in Chi/+ the expression of the early osteoblastogenic markers resulted impaired at 5 days post amputation. Interestingly, a different expression of the bone resorption marker trap in both mutants compared to controls was detected. An anabolic and anti-catabolic combined therapy was attempted using the chemical chaperone, 4-PBA and the bisphosphonate Alendronate in WT and Chi/+ embryos. An amelioration of cranial bones mineralization in mutants was evident. The synthesis of a new drug associating 4-PBA and bisphosphonates was accomplished. Conclusion The impaired bone formation confirmed p3h1-/- and Chi/+ as valid models for recessive and dominant OI and the tail regeneration proved to be a valid tool for drug screening analysis.

Introduzione L'osteogenesi imperfetta (OI) è una malattia ereditaria del collagene di tipo I caratterizzata da fragilità ossea, deformità scheletriche e ritardi nella crescita. L’OI, tradizionalmente, è conosciuta come una malattia causata da mutazioni dominanti nei geni COL1A1 e COL1A2 che codificano per le catene α1 e α2 del collagene tipo I. L’OI di tipo III è, tra le forme dominanti non letali, quella più grave. I pazienti affetti da OI di tipo III sono costretti in sedia a rotelle e soggetti a fratture multiple e deformità scheletriche. Recentemente, sono state identificate forme recessive di OI causate da mutazioni in geni coinvolti nei processi di sintesi, maturazione e folding del collagene di tipo I. Tra queste l’OI di tipo VIII è caratterizzata da osteocondrodisplasia, deformità e fragilità ossea. Essa è causata da mutazioni nel gene P3H1, che codifica per l’enzima prolil 3-idrossilasi 1, membro del complesso di idrossilazione di specifici residui di prolina in posizione C3 sulle catene α del collagene di tipo I. Tra i diversi modelli usati per lo studio di malattie scheletriche, lo zebrafish è ampiamente utilizzato per studiare le basi molecolari di tali patologie, tra cui l’OI, grazie ad alcune sue caratteristiche quali la trasparenza degli embrioni e la conservazione degli stessi processi di ossificazione ed espressione genica dei mammiferi. Durante il mio internato di tesi ho usato due modelli zebrafish, il modello di OI dominante di tipo III, Chihuahua (Chi/+), caratterizzato dalla sostituzione di una glicina nella catena α1 del collagene di tipo I ed il modello di OI recessiva p3h1-/- al fine di studiare la loro capacità di rigenerazione ossea e di testare nuovi trattamenti farmacologici. Risultati L’abilità di formare nuovo osso è stata testata attraverso esperimenti di rigenerazione della coda in pesci di 3 e 8 mesi. Nei mutati p3h1-/- è stata riscontrata una ridotta capacità rigenerativa dell’osso ad entrambe le età, mentre nei Chi/+ solo nei pesci di 3 mesi. La somministrazione dello chaperone chimico 4-fenilbutirrato (4-PBA) ha determinato un incremento nella capacità di rigenerazione ossea solo nel modello p3h1-/-. Durante il differenziamento degli osteoblasti non sono state riscontrate differenze tra i pesci WT e p3h1-/-, mentre nei mutati Chi/+ l’espressione di marcatori precoci di osteoblastogenesi è alterata a 5 giorni dopo l’amputazione. In entrambi i modelli l’espressione del gene trap, indice di attività di riassorbimento osseo, è alterata rispetto ai controlli. Le analisi preliminari sul trattamento con il 4-PBA combinato con il bifosfonato Alendronato hanno mostrato un miglioramento nel livello di mineralizzazione delle ossa craniche nei mutanti Chi/+ rispetto ai WT. Infine, siamo riusciti a sintetizzare una nuova molecola che associa il 4-PBA con il bifosfonato. Conclusioni I due modelli zebrafish, p3h1-/- e Chi/+, rappresentano dei validi strumenti per meglio comprendere le basi molecolari di questa patologia e la rigenerazione della coda può essere sfruttata come tool valido per futuri screening farmacologici.