RUOLO DELLA CITOCHINA PROINFIAMMATORIA INTERLEUCHINA-6 NELLA MODULAZIONE DELL'ATTIVITA’ DELLA RETE NEURONALE IN VITRO

I disordini del neurosviluppo sono un gruppo di patologie che derivano da alterazioni dello sviluppo neuronale e sono caratterizzate, a livello cellulare, da anomalie sinaptiche e da scompensi nel bilanciamento tra tono eccitatorio e inibitorio, che si riflettono in un’alterata funzionalità della rete neuronale. Diverse evidenze hanno portato ad individuare stati infiammatori acuti precoci, in particolare quelli che si verificano durante il periodo prenatale, come una possibile causa dell’insorgenza di queste malattie. L’interleuchina 6 (IL-6) è una delle numerose molecole che interviene in questi processi e diverse evidenze ne attribuiscono un ruolo primario nella determinazione di essi. Tuttavia, i meccanismi alla base del processo di alterazione della rete neuronale da parte di IL-6 non sono noti. Abbiamo quindi deciso di indagare l’azione di questa citochina sullo sviluppo della rete neuronale mimando una infiammazione transiente tramite l’applicazione di IL-6 in colture neuronali ippocampali nelle fasi iniziali dello sviluppo che precedono la formazione di sinapsi e valutando la funzionalità della rete neuronale in stadi maturi. Tramite l’impiego di un sistema CMOS HD-MEA abbiamo registrato l’attività elettrica della rete neuronale in colture a diverse tempistiche nello sviluppo e abbiamo osservato che, a differenza di quanto accade in una coltura di controllo, la frequenza di scarica media (MFR) delle colture trattate con IL-6 non subisce un aumento progressivo col progredire dello sviluppo. Per spiegare la riduzione di MFR osservata abbiamo ipotizzato che il trattamento possa determinare un’alterazione dell’eccitabilità intrinseca di membrana nei neuroni durante lo sviluppo. Per testare la nostra ipotesi abbiamo quindi condotto registrazioni di patch clamp in configurazione di current-clamp valutando l’eccitabilità intrinseca di neuroni trattati con IL-6 rispetto a neuroni di controllo in presenza di bloccanti della trasmissione GABAergica e glutamatergica, impedendo che la genesi di potenziali d’azione potesse essere influenzata dall’attività spontanea dei neuroni con cui forma contatti sinaptici. La valutazione del numero di potenziali d’azione generati per corrente iniettata non ha mostrato alcuna differenza in questo parametro tra le due condizioni, né a 7 DIV né a 14 DIV. Avendo escluso un’azione di IL-6 sull’eccitabilità intrinseca dei neuroni abbiamo deciso di indagare possibili effetti a carico della trasmissione glutamatergica, valutando la densità di spine dendritiche e di sinapsi eccitatorie tra le due condizioni. Queste valutazioni sono state effettuate co-trasfettando i neuroni a 7 DIV con PSD-FingR ed una proteina fluorescente di controllo, Tomato, per visualizzare l’intero albero dendritico, e sottoposti ad immunofluorescenza a 14 DIV per marcare Bassoon. Dall’analisi delle immagini non è stata riscontrata alcuna differenza fra le due condizioni né nella densità di spine dendritiche né nella densità sinaptica. Tuttavia, valutando la precisa localizzazione dei contatti sinaptici lungo il segmento dendritico abbiamo notato che i neuroni trattati con IL-6 presentano una percentuale maggiore di contatti sinaptici localizzati a livello del ramo dendritico e una percentuale minore di sinapsi localizzate sulle spine dendritiche rispetto ai neuroni di controllo. Inoltre, a fronte di una comparabile densità di spine dendritiche fra le due condizioni, le colture trattate con IL-6 presentano una significativa riduzione nella percentuale di spine dendritiche caratterizzate da un contatto sinaptico. Nel complesso questi dati mostrano che un fenomeno infiammatorio transiente durante le fasi dello sviluppo neuronale, caratterizzato da aumentati livelli di IL-6, potrebbe determinare una alterazione dei corretti processi di localizzazione delle sinapsi eccitatorie lungo i rami dendritici, portando ad una riduzione dell’attività neuronale in stadi maturi.