Approcci computazionali integrativi per la modellazione degli insiemi strutturali del recettore tirosina chinasi MuSK

The aim of this thesis is to develop a detailed molecular model for the conformational ensembles describing the extracellular region of MuSK, a receptor tyrosine kinase crucial for the development of neuromuscular junctions (NMJ). Our approach combines multiple experimental data (including crystal structures, functional data and cross-linking mass spectrometry (XL-MS) constraints) with theoretical methods (such as molecular simulations at different scales). The NMJ is a chemical synapse characterized by the contact site between the motor neuron axon (presynaptic side) and the muscle cell surface (postsynaptic side); Schwann cells surround both the overall synaptic button and the axon terminal and. Formation and stabilization of NMJ is regulated by multiple complex signal transduction cascades. Among these, MuSK whose activities depend on interactions between MuSK and a variety of signaling macromolecules, including its soluble extracellular ligand Agrin, the coreceptor Lrp4, as well as important developmental regulators such as the intracellular receptor-associated protein RapSyn and soluble Wnt singling molecules. MuSK’s extracellular region is composed of 3 immunoglobulin domains (Ig) followed by a frizzled-like cysteine-rich domain (Fz), then the receptor displays its single transmembrane helix and the intracellular tyrosine kinase domain at the C-terminus. Dimerization of the MuSK ectodomain is essential for its activation. However, a model for MuSK dimeric organization is not available at the moment. We initially built a model for the MuSK ectodomain monomer, by combining a crystal structure of the first three Ig domains of human MuSK with a structure of the Fz domain of rat MuSK. The creation of this model required homology modelling of the human MuSK Fz domain. A total of 8 MuSK ectodomain monomer models were generated by varying in the orientation of the Fz domain with respect to the N-terminal Ig domains. To generate an extended sampling of the conformational space of the protein, Molecular Dynamics routines using the SIRAH coarse-grained force field. Trajectories of tens of microseconds were produced and then clustered, extracting the 41 most representative conformations. These monomers were then combined for the construction of dimeric models. In this phase, 900 models were produced and the cases that best reproduce the experimental data were selected by computing the difference between the theoretical small-angle X-ray scattering (SAXS) curves for each structure and their comparison with the experimental SAXS curve obtained for MuSK ectodomain (i.e. through evaluation of χ2 values below 4). The dimers and the SAXS curves were further computed with the Sasref software. The group of dimers with the minimal values of χ2 was further reduced by discarding the models showing distance values between the residues K65 and K69 not compatible with cross-links experimentally detected by XL-MS. In conclusion, this thesis work focused on the production of a computational ensemble of structures of MuSK ectodomain quaternary assemblies coherent with various experimental data, representative of the constitutive dimeric organization of the receptor in absence of coreceptors or ligands. These dimeric structures suggest extremely high molecular flexibility: the two MuSK monomers interacting through Ig1 and Ig2 domains form a flexible complex that can explore a multitude of conformations, possibly supporting the basal activity of the receptor dependent on a limited subset of productive arrangments of the C-terminal transmembrane region and subsequent intracellular kinase domains. Taken together, the generated models provide an integrative structural description of the MuSK extracellular region, supporting its ability to interact with its numerous biological partners.

Questo lavoro di tesi mira a sviluppare un modello dettagliato degli insiemi strutturali accessibili alla proteina MuSK, un recettore fondamentale nei processi di sviluppo della giunzione neuromuscolare (NMJ). Il nostro approccio combina diversi tipi di esperimenti (strutturali, funzionali e di cross-linking), approcci teorici (simulazioni molecolari su scale diverse) ed analisi statistiche per calcolare modelli molecolari di sistemi biologici complessi. La NMJ è classificabile come sinapsi chimica, costituita dal contatto tra l’assone del motoneurone (lato presinaptico), il sito sulla superficie del sarcolemma su cui avviene l’innervazione (lato postsinaptico) e le cellule di Schwann che circondano il bottone sinaptico e si estendono al terminale assonico presinaptico. La formazione delle NMJ è regolata da complessi meccanismi biochimici caratterizzati da molteplici vie di trasduzione del segnale. Tra queste, il recettore MuSK la cui attività dipende dall’interazione con numerose macromolecole tra cui il suo ligando extracellulare Agrin, il corecettore Lrp4, e importanti regolatori del differenziamento cellulare tra cui la proteina associata ai recettori RapSyn e le proteine segnale della cascata Wnt. La regione extracellulare di MuSK è caratterizzata da 3 domini immunoglobulinici e un dominio Frizzled-like (Fz), ricco di cisteine. A seguire, è presente l’elica transmembrana e il dominio tirosina chinasi intracellulare. L’unità funzionale critica per l’attivazione del signaling sembra essere un’interfaccia di dimerizzazione nella porzione extracellulare, di cui ad oggi non esiste un modello ben definito. Inizialmente si sono generati più modelli computazionali combinando le strutture cristallografiche note dei domini immunoglobulinici di MuSK umana (disponibili in letteratura e determinate precedentemente nel nostro laboratorio) con le strutture pubblicate del dominio Fz murino. Questo primo step si è compiuto combinando la generazione di un modello per omologia per la struttura del dominio Fz di MuSK umana, con la costruzione del loop che unisce Fz al dominio immunoglobulinico. In totale si sono generati 8 modelli del monomero di MuSK, con diverse conformazioni di partenza. Per campionare lo spazio conformazionale delle diverse strutture, abbiamo eseguito dinamiche molecolari nella scala delle decine di microsecondi utilizzando il force-field coarse grained SIRAH. In seguito tramite cluster analysis sulle traiettorie ottenute si sono isolate 41 strutture rappresentative della mobilità conformazionale della porzione extracellulare di MuSK. Le diverse strutture monomeriche sono state poi combinate per ottenere modelli di dimero. Per ciascun dimero abbiamo calcolato la intensità teoriche di scattering di raggi X (SAXS). Abbiamo considerato validi solo i modelli strutturali con una deviazione minima dai valori determinati sperimentalmente per la regione extracellulare di MuSK (χ2 minore di 4) poi è stata valutata la distanza tra i residui di Lisina (K65 e K69) appartenenti a monomeri diversi e identificati come coinvolti in cross-links da dati sperimentali di spettrometria di massa accoppiata a cross-linking (XL-MS). In conclusione si può confermare che la porzione extracellulare del recettore formi costitutivamente strutture quaternarie di tipo dimerico. In queste strutture quaternarie, due monomeri di MuSK interagiscono principalmente attraverso i rispettivi domini Ig1 ed Ig2 formando un complesso altamente flessibile in cui sono possibili punti di contatto aggiuntivi che coinvolgono anche i domini Ig3 e Fz. I modelli generati forniscono per la prima volta una possibile descrizione molecolare dei processi che possono portare all’attivazione del recettore in assenza di ligandi specifici, responsabile della sua attività.