Strategie di espressione del dominio extracellulare del recettore sensibile al calcio (CaSR-ECD)

The calcium-sensing receptor (CaSR) is a dimeric G-protein coupled receptor (GPCR), ubiquitously expressed in the human organism. In calciotropic tissues, such as parathyroid glands, kidneys and bones, CaSR enhanced expression allows for the upkeep of calcium homeostasis, by extracellular calcium signal transduction. This implies its involvement in several physiological pathways, among which parathyroid hormone secretion, lactation and skeletal development. CaSR functional characterization led to the understanding of its multivariate role, achieved by the interaction with several intracellular partners. Indeed, based on the tissue specificity and the pathophysiological status, it can interact with four different G-proteins, with arrestins and G-protein receptor kinases (GRKs). Moreover, CaSR involvement in several carcinogenic tissues was highlighted in the past years. Although, up to date, the full-length structure of this receptor has not been described yet. The crystal structure of the extracellular domain of CaSR (CaSR-ECD) was first solved in 2016 by Fan and colleagues and it allowed the identification of different ligand binding. The production of functional GPCRs has proven to be a tricky process, typically requiring considerable time and cost investments. Thus, this experimental work aimed at the identification of effective expression strategies of CaSR-ECD. Given the properties Pichia pastoris showed for high-throughput GPCRs expression, we first tried to optimize CaSR-ECD expression in this organism using both the native CaSR export sequence and the yeast -factor. We finally tested a mammalian expression system by using human embryonic kidney 293-T antigen (HEK293T) cells. CaSR-ECD transient expression in HEK293T cells led to the successful identification of the target domain. Nonetheless, this expression system requires longer preparation time to obtain a stable transfection and to scale-up the protein production.

Il recettore sensibile al calcio (calcium-sensing receptors, CaSR) appartiene alla famiglia C delle GPCRs ed è espresso in più organi e tessuti dell’organismo umano. Tra questi ci sono le ghiandole paratiroidi, i reni e le ossa, dove l’omeostasi del calcio è mantenuta dall’espressione di CaSR tramite la trasduzione del segnale extracellulare del calcio. Questo implica il coinvolgimento del recettore in diversi pathways fisiologici, tra cui la secrezione dell’ormone paratiroideo, l’allattamento e lo sviluppo scheletrico. La caratterizzazione funzionale di CaSR ha portato alla comprensione dei suoi ruoli, grazie all’interazione con diversi partner intracellulari. In base alla specificità tissutale e allo stato fisiopatologico, questo recettore può interagire con quattro diverse proteine G, con le arrestine e con le chinasi dei recettori accoppiati a proteine G. Inoltre, negli ultimi anni è stato evidenziato il coinvolgimento di CaSR in diversi tessuti tumorali. Ad oggi, la struttura completa di questo recettore non è stata ancora definita. La struttura cristallina del dominio extracellulare di CaSR (CaSR-ECD) è stata risolta per la prima volta nel 2016 da Fan e colleghi e ha consentendo l'identificazione di diversi siti di legame per i ligandi. La produzione di GPCRs è un processo complicato, che in genere richiede notevoli investimenti in termini di tempo e costi. Pertanto, questo lavoro sperimentale mira ad identificare strategie di espressione di CaSR-ECD, utilizzando diversi modelli. Date le proprietà che Pichia pastoris ha mostrato per l'espressione di altre GPCRs, abbiamo cercato di ottimizzare l'espressione di CaSR-ECD in questo organismo, usando sia la sequenza segnale di export nativa di CaSR, sia l’-factor di lievito. Abbiamo infine testato un sistema di espression in mammifero, utilizzando le cellule di rene embrionale umano 293 con antigene T (HEK293T). L'espressione transiente di CaSR-ECD nelle cellule HEK293T ha portato alla corretta identificazione del dominio target. Tuttavia, questo sistema di espressione richiede un tempo di preparazione più lungo per ottenere una trasfezione stabile e aumentare la produzione di proteine.