Studio del meccanismo molecolare alla base dell’attività antiproliferativa dell’acido retinoico nel carcinoma della mammella: il ruolo di DTX3L.

Retinoids are synthetic and natural derivatives of vitamin A and are able to induce differentiation and/or apoptosis in cancer cells. Retinoids have a great potential as chemotherapy or chemo-preventive agents. All-trans retinoic acid (ATRA) was the first example of a cyto-differentiating agent used in clinical practice. Thanks to the success of ATRA in the context of acute promyelocytic leukemia (APL), a keen interest has developed for its potential therapeutic use in other types of cancer, such as breast cancer. The purpose of this thesis is the study of the molecular mechanism underlying the antiproliferative action of ATRA in breast cancer and we focused on the role of the DTX3L gene. RNA sequencing studies on breast cancer cell lines, differently sensitive to the antiproliferative action of the retinoid, have shown that the interferon signal transduction pathway is specifically activated by the retinoid in sensitive cell lines. Among the genes of this signaling pathway, IRF1 and DTX3L are related to the antiproliferative response of ATRA. IRF1 has already been described as a mediator of the antiproliferative response of ATRA in APL and other solid cancers. Particularly, we used the SK-BR-3 cell line as a prototype of ATRA sensitivity to evaluate the role of DTX3L. The use of specific agonists of the three retinoid’s nuclear receptor, RARα, RARβ and RARγ, made it possible to identify RARα as a specific modulator of DTX3L expression. Treatment with various antiproliferative agents has highlighted that the induction of DTX3L expression by ATRA is specific. To assess the functional role of DTX3L in retinoid-mediated growth inhibition, we generated cell lines stably expressing shRNA against DTX3L. In these cell lines, the antiproliferative action of ATRA is significantly increased, indicating the role of DTX3L as a negative regulator of action of ATRA to inhibit cell growth. RNA sequencing analysis showed the ability of ATRA to activate the expression of retroviral transcripts, supporting the hypothesis of involvement DTX3L and IRF1 as part of a possible mechanism of viral mimicry. This would explain the activation of interferon signaling pathway by ATRA. Treatment with the retinoid was found to be able to activate the phosphorylation of TBK1, a crucial mediator of the viral mimicry process. To assess whether DTX3L and IRF1 had a specific effect within this mechanism, the SKBR3 line was transfected with Poly (I: C) or treated with drugs capable of triggering the "viral mimicry" process. All cases showed the induction of IRF1 and DTX3L. In conclusion, the data obtained support the importance of the "viral mimicry" mechanism in the antiproliferative action of ATRA and identify IRF1 and DTX3L as genes involved in this process.

I retinoidi, sono derivati sia sintetici che naturali della vitamina A e sono in grado di indurre differenziamento e/o apoptosi nelle cellule tumorali. I retinoidi hanno, quindi, un grande potenziale come agenti chemioterapici o chemio-preventivi. L’acido retinoico tutto-trans (ATRA) è stato il primo esempio di agente citodifferenziante utilizzato nella pratica clinica. Grazie al successo di ATRA nell’ambito della leucemia promielocitica acuta (APL), si è sviluppato un acceso interesse per il suo potenziale utilizzo terapeutico in altri tipi di cancro, come il tumore alla mammella. Scopo della presente tesi è lo studio del meccanismo molecolare alla base dell’azione antiproliferativa di ATRA nel carcinoma della mammella. In particolare, ci si è concentrati sul ruolo del gene DTX3L. Infatti, studi di RNA-sequencing su linee cellulari tumorali di carcinoma della mammella, diversamente sensibili all’azione antiproliferativa del retinoide, hanno evidenziato come la via di trasduzione del segnale dell’interferone rappresenti una via specificamente attivata dal retinoide nelle linee sensibili. Tra i geni di questa via di segnalazione, IRF1 e DTX3L risultano correlati alla risposta antiproliferativa di ATRA. IRF1 è già stato descritto come mediatore della risposta antiproliferativa di ATRA nell’APL ed in altri carcinomi solidi. Per valutare il ruolo di DTX3L, abbiamo utilizzato la linea SKBR3 quale prototipo della sensibilità ad ATRA. Il retinoide è risultato in grado di indurre specificamente l’espressione di DTX3L. L’utilizzo di specifici agonisti per i tre recettori nucleari del retinoide, RARα, RARβ e RAR, ha permesso di identificare RARα quale specifico modulatore dell’espressione di DTX3L. Il trattamento con diversi agenti antiproliferativi ha evidenziato la specificità di ATRA nell’indurre l’espressione di DTX3L. Per valutare il ruolo funzionale di DTX3L nell’azione di inibizione della crescita mediata dal retinoide abbiamo generato linee cellulari stabilmente esprimenti shRNAs contro DTX3L. In tali linee l’azione antiproliferativa di ATRA risulta significativamente aumentata ad indicare il ruolo di DTX3L nel regolare negativamente la capacità di ATRA di inibire la crescita cellulare. Poiché da analisi di RNA sequencing è emersa la capacità di ATRA di attivare l’espressione di trascritti retrovirali si è voluta vagliare l’ipotesi di un coinvolgimento di DTX3L ed IRF1 nell’ambito di un possibile meccanismo di “viral mimicry” mediato dal retinoide. Ciò, infatti, spiegherebbe l’attivazione della via di segnalazione dell’interferone da parte di ATRA. Il trattamento con il retinoide è risultato essere in grado di attivare la fosforilazione di TBK1, un mediatore cruciale del processo di viral mimicry. Per valutare se DTX3L ed IRF1 avessero un effetto specifico nell’ambito di tale meccanismo, la linea SKBR3 è stata trasfettata con Poli (I:C) o trattata con farmaci in grado di innescare il processo di “viral mimicry”. In tutti i casi si è osservata l’induzione di IRF1 e DTX3L. Concludendo, i dati ottenuti supportano l’importanza del meccanismo della “viral mimicry” nell’azione antiproliferativa di ATRA ed identificano IRF1 e DTX3L come geni coinvolti in tale processo.