Caratterizzazione del ruolo del Progesterone Receptor Membrane Component 1 (PGRMC1) durante le prime fasi dello sviluppo embrionale nella specie bovina.

Il Progesterone Receptor Membrane Component 1 (PGRMC1) è una proteina multifunzionale inizialmente identificata nel fegato come proteina legante il progesterone. Tuttavia, il PGRMC1 è espresso in numerosi tipi cellulari e possiede funzioni dipendenti e indipendenti dal progesterone. Negli ovociti bovini il PGRMC1 cambia la sua localizzazione durante le varie fasi della progressione meiotica: è associato ai cromosomi durante la metafase I e II, mentre si localizza nella regione del “midzone” e “midbody” del fuso meiotico durante l’anafase e telofase rispettivamente, che precedono all’emissione del primo globulo polare. La localizzazione del PGRMC1 negli ovociti bovini in maturazione rispecchia la sua localizzazione in cellule della granulosa bovine (bGC) in divisione, in particolare nella parte centrale del fuso, suggerendo una possibile azione comune nella mitosi e nella meiosi. Questa ipotesi è stata confermata tramite esperimenti che mostrano che l’alterazione della funzione del PGRMC1 mediante l’utilizzo di un inibitore (AG-205) o la riduzione della sua espressione mediante RNA interference (RNAi) provoca un’alterazione dell’abilità degli ovociti di completare correttamente la maturazione, emettere il primo globulo polare e arrangiare i cromosomi sulla piastra metafasica. Inoltre esperimenti di live imaging condotti su colture di cellule della granulosa di bovino hanno dimostrato che la ridotta espressione del PGRCM1 indotta da RNAi interferisce con la corretta progressione della divisione mitotica ed in particolare con il processo di cariocinesi e citodieresi. Lo scopo del presente studio è stato quello di indagare la funzione del PGRMC1 durante le prime fasi dello sviluppo embrionale utilizzando il bovino come modello sperimentale. A tale scopo sono stati condotti una serie di esperimenti volti a valutare l’effetto del trattamento con AG205 su embrioni della specie bovina ottenuti in vitro. Una volta stabiliti gli effetti del trattamento con AG-205, si è valutato se la possibile aggiunta di progesterone potesse revertire l’effetto del trattamento. Inoltre, dato che il PGRMC1, sembra interagire con il fuso mitotico si è voluto analizzare se il PGRMC1 interagisce direttamente con altri elementi citoscheletrici essenziali per il processo di divisione cellulare, quali la Miosina II. A tale scopo la localizzazione del PGRMC1/Miosina II è stata valutata mediante immunofluoscerenza indiretta in cellule della granulosa bovina, utilizzate come modello sperimentale e, successivamente, la tecnica della in situ “Proximity ligation assay”, è stata utilizzata per verificare una possibile diretta interazione tra le due proteine. L’analisi dei dati ottenuti indica che il trattamento con AG-205 altera la capacità dell’embrione di formare blastomeri mononucleati, aumentando significativamente la percentuale di blastomeri multi-nucleati o anucleati ed indicando, quindi, che l’alterazione dell’attività di PGRMC1 potrebbe portare ad una mancata o non corretta citodieresi. L’effetto del trattamento con AG205 non è stato attenuato dalla co-incubazione con il progesterone ad indicare che, probabilmente, l’attività del PGRMC1 non dipende dal progesterone in questo tipo cellulare. Infine, i dati ottenuti tramite immunofluorescenza indiretta e in situ PLA hanno rivelato che il PGRMC1 co-localizza e interagisce con la Miosina-II. Questo dato supporta l’ipotesi che il PGRMC1 possa avere ruolo nel mediare i riarrangiamenti citoplasmatici che guidano le divisioni cellulari nelle prime fasi dello sviluppo embrionale e, in particolare nel regolare la funzione dell’anello contrattile di actina-miosina durante la citodieresi. La ricerca dei fattori che mediano e regolano le prime fasi dello sviluppo embrionale nei mammiferi e la cinetica di divisione dell’embrione in modelli animali è fondamentale per meglio comprendere le cause di infertilità.