TECNICHE DI SINGLE-CELL IMAGING PER L'ANALISI DELL’ESPRESSIONE DELL’OPERONE pgs IN B. subtilis

L’operone pgs contiene i geni necessari per la trascrizione di un complesso multienzimatico transmembrana, la poli-γ-glutammato sintetasi, che permette la formazione dell’acido poli-γ-glutammico (γ-PGA). Quest’ultimo è un polimero che suscita forte interesse in molti settori industriali grazie a diverse proprietà, come l’abilità di legare ioni metallici, la capacità di trattenere acqua, la biodegradabilità e l’atossicità, legate alla sua conformazione amminoacidica. La trascrizione dell’operone e, di conseguenza, la produzione di γ-PGA in B. subtilis è osservabile solo in presenza di una proteina accessoria, SwrA, la cui funzione rimane oscura, e del regolatore trascrizionale DegU in forma fosforilata (DegU~P), appartenente al sistema a due componenti DegS-DegU. Nonostante quest’ultimo fattore regoli l’espressione di più di cento geni, la sequenza consensus per il legame al DNA non è stata identificata e la sua interazione con SwrA non è mai stata definita. Il lavoro svolto si è focalizzato sull’identificazione del sito di legame di DegU sul promotore dell’operone pgs in Bacillus subtilis. In questo progetto, per mappare il sito di legame di DegU~P, è stato costruito un plasmide che può accomodare frammenti di dimensione differenti della regione a monte di Ppgs. A valle di questi è presente un sito di legame del ribosoma (RBS), seguito dal gene codificante la GFP. Questo sistema reporter può essere inserito nel locus esogeno amyE di Bacillus subtilis, grazie a due regioni fiancheggianti di omologia che guidano l’integrazione nel cromosoma. Grazie a questo plasmide sono stati creati finora ceppi in cui l’espressione della GFP è guidata da porzioni di 2000bp, 1500bp e 400bp prima del sito di trascrizione del gene pgsB e che possiedono anche il contesto genetico necessario all’attivazione del promotore (swrA+ e degU32(Hy)). Inoltre, come controlli negativi, i ceppi contenenti la porzione più estesa del promotore, 2000bp, sono stati inseriti in ceppi mancanti di una o entrambe le caratteristiche genetiche necessarie all’espressione dell’operone. In aggiunta, per verificare che l’espressione della GFP non fosse in realtà guidata da un secondo promotore più a monte di quello conosciuto, mutazioni puntiformi inattivanti sono state inserite nell’inserto da 2000bp. Questi ceppi sono stati analizzati attraverso tecniche di microscopia a fluorescenza e citofluorimetria a flusso per visualizzare la fluorescenza emessa. I ceppi utilizzati come controlli negativi non hanno prodotto fluorescenza, confermando che l’attivazione del promotore di pgsB, e quindi la produzione di γ-PGA, avviene quando i batteri producono la proteina SwrA funzionale (allele swrA+) e possiedono la mutazione degU32(Hy). Inoltre, è stato possibile confermare che il promotore putativo di pgsB identificato in letteratura è corretto, in quanto, se inattivato, l’espressione della GFP è annullata. Grazie ai costrutti con porzioni progressivamente ridotte della regione a monte di Ppgs è stato possibile limitare a circa 1100bp la regione necessaria per l’attivazione del promotore. Infatti, i ceppi in cui sono presenti le porzioni di 2000bp e 1500bp hanno prodotto la GFP, a differenza del ceppo in cui è presente il frammento da 400bp, confermando che almeno un sito di legame di DegU~P è presente in questa regione. Grazie al nuovo plasmide creato è stato quindi sviluppato un sistema che permetterà l’individuazione del sito di legame di DegU~P sull’operone pgs. Successivamente si potrà studiare l’interazione tra DegU~P e SwrA e determinare il ruolo svolto da quest’ultima sulla trascrizione dei geni regolati dal sistema a due componenti DegS-DegU.