Analisi degli effetti di PAI-1 sulla funzionalità a lungo termine delle cellule staminali ematopoietiche umane post Gene Editing

Recently, our lab shed light on the mechanisms occurring in hematopoietic stem and progenitors cells (HSPC) upon gene editing (GE) procedure performed with the CRISPR/Cas9 system. Indeed, we reported that nuclease-induced double strand break followed by delivery of a DNA repair template by Adeno-Associated Virus serotype 6 during GE triggers a robust activation of the p53-mediated DNA Damage Response pathway as predominant response. Intriguingly, our in depth transcriptomic analysis up to the single cell level also showed that GE leads to the transcriptional activation of pro-inflammatory programs across different HSPC types and states with consequent impaired functionality of edited cells both in vitro and upon transplantation into immunodeficient mice. Among the upregulated proinflammatory pathways, we identified the Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1)-mediated coagulation and complement program, as one of the main contributors to the dysfunctions of edited HSPC. Indeed, PAI-1 was shown to negatively regulate hematopoietic regeneration in the bone marrow microenvironment and long-term hematopoiesis, likely through the regulation of cellular senescence, a complex phenomenon characterized by cell cycle arrest and widespread activation of inflammatory cytokines. Here, we reasoned that PAI-1 could contribute to the reduced clonogenic potential of gene-edited HSPC and devised a strategy based on PAI-1 inhibition to counteract GE-related inflammation and enhance the long-term repopulating potential of gene-edited HSPC.

Recenti ricerche condotte nel nostro laboratorio hanno messo in luce i meccanismi che si attivano nelle cellule staminali ematopoietiche umane (HSC) in seguito alla procedura di editing genetico (GE), eseguita mediante l’utilizzo della tecnologia CRISPR/Cas9. Questo promettente sistema si basa sull’impiego della nucleasi batterica Cas9, una sorta di forbice molecolare in grado di tagliare una sequenza bersaglio nel DNA la cui individuazione avviene grazie ad una molecola di RNA, chiamata RNA guida, complementare a quella del sito che si vuole tagliare sul DNA. La rottura a doppio filamento (DSB) che si produce verrà poi riparata mediante saldatura delle estremità non omologhe (NHEJ) o riparazione omologa (detta anche riparazione assistita da stampo). Nonostante i numerosi campi terapeutici di applicazione, che spaziano dalle malattie genetiche rare al cancro, il GE presenta però alcune criticità. Infatti, abbiamo recentemente dimostrato che il DSB indotto dalla nucleasi e l’introduzione di un templato di DNA esogeno mediante un virus adeno-associato, dato affinché possa avvenire il riparo del danno per ricombinazione omologa, innescano una robusta attivazione del pathway di p53. Inoltre, grazie ad analisi trascrittomiche eseguite fino al livello di singola cellula, si è visto che la procedura di GE porta all’attivazione di programmi pro-infiammatori nelle diverse sottopopolazioni di staminali ematopoietiche, compromettendone la funzionalità sia in vitro che in vivo quando vengono trapiantate in topi immunodeficienti. Tra i programmi proinfiammatori up-regolati in seguito a GE abbiamo identificato come potenziale responsabile della disfunzionalità delle HSC il pathway della coagulazione e del complemento mediato da PAI-1 (inibitore dell'attivatore del plasminogeno di tipo 1). Di fatto, è stato dimostrato che PAI-1 regola negativamente l’ematopoiesi a lungo termine e la ricostituzione ematopoietica nel midollo osseo, probabilmente attraverso il processo di senescenza cellulare, un complesso fenomeno caratterizzato da un arresto del ciclo cellulare e dalla massiva produzione di citochine infiammatorie. Per questa ragione abbiamo ipotizzato che PAI-1 potesse essere tra i responsabili del ridotto potenziale clonogenico delle HSC editate e abbiamo disegnato una strategia basata sull’utilizzo di un inibitore, TM5441, che a basse dosi si è dimostrato efficace nell’aumentare il potenziale clonogenico delle HSC e nella riduzione di alcune citochine pro-infiammatorie chiave caratteristiche della SASP (Senescence Associated Secretory Phenotype). Parallelamente abbiamo mimato l’over-espressione di PAI-1 che si verifica in seguito alla procedura di editing somministrando a cellule progenitrici ematopoietiche PAI-1 ricombinante esogeno ed abbiamo scoperto che la sua somministrazione in acuto induce un aumento del potenziale clonogenico delle HSC e di alcune citochine pro-infiammatorie mentre quando viene somministrato cronicamente, specialmente ad alte dosi, ne compromette la funzionalità.