Effetti biologici in cellule BM-MSC di sistemi nanoparticellari a base di acido ialuronico: studio comparativo

Nanomedicine is an innovative and versatile field of medicine able to improve the treatment of different diseases. Basically, nanomedicine develops innovative nanometric drug delivery systems capable of modulating the biodistribution and the selectivity of the drugs, improving their effectiveness and limiting their side effects. CD44 is a transmembrane glycoprotein recognized as one of the main membrane antigens of mesenchymal stem cells, but also as a molecular marker for several types of cancer cells. CD44 is also often highly expressed in a variety of inflammatory diseases. Since Hyaluronic Acid (HA) is the main natural ligand of CD44 receptor, nanotechnology has making efforts to develop HA based NPs capable of selectively targeting CD44 over-expressing cells and delivering drugs. The aim of this thesis is to analyze the biological effects on CD44+ human bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC) of Hyaluronic Acid Nanoparticles with three different molecular weights (280 KDa, 540 KDa and 820 KDa) and synthesized by microfluidic systems. Evaluation studies were carried out relating to: cytocompatibility, analized by the MTT assay; cell proliferation, by incorporation of Bromodeoxyuridine revealed by immunocytochemistry; mechanisms of nanoparticles cell internalization, evaluated by immunocytochemical analysis of samples treated with specific inhibitors of biochemical processes. The inhibitors used are: chlorpromazine, which inhibits clathrin-mediated endocytosis by binding to calmodulin; cytochalasin A, which inhibits actin elongation and polymerization and can therefore inhibit macropinocytosis, clathrin-mediated endocytosis and also various mechanisms of clathrin-independent endocytosis; genistein, which inhibits tyrosine kinases in the context of caveole-mediated endocytosis; nocodazole, which inhibits the polymerization of cytoskeletal microtubules, which are essential components for clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis; anti-CD44 antibody, which blocks specific uptake pathway for HA / CS NPs. The results obtained show that all 3 nanoparticulate formations of hyaluronic acid of different molecular weights are cytocompatible with BM-MSC cells and they were no influent in cells proliferation activity. All the HA NPs were selective for the CD44 receptors. HA NPs uptake studies have demonstrated that the HA Mw could influence the uptake of the NPs: 280 KDa NPs are internalized only by clathrin-mediated endocytosis, while 820 KDa NPs use caveola-mediated endocytosis, macropinocytosis and other clathrin-independent pathways (they seem to rather use cytoskeleton-linked mechanisms). The uptake of 540 KDa NPs, occurs through all the pathways already mentioned.In conclusion, the HA Mw does not cause changes in cytocompatibility or cell proliferation, but instead affects the mechanisms in which NPs are internalized in cells.

La nanomedicina è un’innovativa branca della medicina che sfrutta sistemi nanoparticellari come device per la somministrazione di farmaci o come farmaci essi stessi, con l’obiettivo di migliorarne l'efficacia e la selettività e ridurne gli effetti dannosi e i meccanismi di resistenza. Uno degli antigeni tumorali studiati per il targeting farmacologico tramite nanoparticelle è CD44, il cui ligando principale è l'acido ialuronico (HA). CD44 è uno dei principali antigeni di membrana delle cellule staminali mesenchimali, ma viene riconosciuto come marcatore molecolare anche per le cellule di diversi tipi di tumore. CD44 è spesso altamente espresso anche in una varietà di malattie infiammatorie. L’acido ialuronico, in quanto suo principale ligando, può essere utilizzato come vettore nanoparticellare per bersagliare selettivamente le cellule patologiche over-esprimenti CD44 con agenti farmacologici. In questo elaborato di tesi vengono analizzati gli effetti biologici di Nanoparticelle a base di Acido Ialuronico e Chitosano, di tre diversi pesi molecolari (280 KDa, 540 KDa e 820 KDa), sintetizzate tramite sistemi di microfluidica, su cellule staminali mesenchimali CD44+ di midollo osseo umano. Sono stati condotti studi di valutazione relativi a: citocompatibilità, tramite saggio MTT; proliferazione cellulare, tramite incorporazione di Bromodeossiuridina rivelata con saggio immunocitochimico; meccanismi di internalizzazione cellulare delle nanoparticelle, valutati tramite analisi immunocitochimica dei campioni trattati con inibitori specifici di alcuni processi biochimici coinvolti. Gli inibitori utilizzati sono: cloropromazina, che inibisce l’endocitosi clatrina mediata legandosi alla calmodulina; citocalasina A che inibisce l’allungamento e la polimerizzazione dell’actina e che può quindi inibire la macropinocitosi, l'endocitosi clatrina-mediata e anche diversi meccanismi di endocitosi indipendenti dalla clatrina; genisteina, che inibisce le tirosin-chinasi nell’ambito dell’endocitosi caveole-mediata; nocodazolo, che inibisce la polimerizzazione dei microtubuli del citoscheletro, essenziali per l’endocitosi clatrina-mediata e per la macropinocitosi; anticorpo anti-CD44, che blocca la via di uptake specifica per le NPs HA/CS. I risultati ottenuti hanno mostrato che tutte 3 le formulazioni nanoparticellari di acido ialuronico a pesi molecolari diversi sono citocompatibili con le cellule BM-MSC e non influenzano in modo significativo l’attività di proliferazione cellulare. La selettività per l’antigene CD44 è propria di tutte 3 le tipologie di nanoparticelle. Diversamente, il peso molecolare (P.M.) sembra influenzare il meccanismo di internalizzazione delle nanoparticelle: NPs con P.M. 280 KDa vengono infatti internalizzate unicamente tramite un meccanismo di endocitosi clatrina-dipendente, mentre le nanoparticelle 820 KDa sfruttano le caveole, la macropinocitosi e altri meccanismi indipendenti dalla clatrina (in generale si avvalgono di meccanismi più legati al citoscheletro). L’uptake delle NPs a P.M. intermedio (540 KDa) avviene attraverso tutti i meccanismi di internalizzazione sopracitati. Il P.M. dell’HA, in conclusione, non determina cambiamenti nella citocompatibilità né nella proliferazione cellulare, ma influisce invece sui meccanismi in cui le NPs vengono internalizzate nelle cellule.