Realizzazione di un modello di osteosarcoma mediante 3D bioprinting per l'applicazione sperimentale della Terapia per Cattura Neutronica del Boro (BNCT): aspetti metodologici.

Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor affecting children and adolescents. Despite the introduction of several treatment options, osteosarcoma still remain a challenge to treat and cure, due to its infiltrative growth that leads to a high incidence of metastasis and, therefore, to low survival rates. For this reason, Boron Neutron Capture Therapy (BNCT), an experimental binary radiotherapy, has been investigated as an alternative or integrative treatment. BNCT is based on the thermal-neutron irradiation of neoplastic cells previously enriched with a non-radioactive stable isotope of boron (10B). The subsequent neutron capture reaction in boron release two ionizing particles that dissipate all their energy in a distance comparable to the diameter of a cell, causing non reparable damages to DNA and thus providing a way to selectively destroy cancer cells while sparing surrounding normal cells. Specifically, we developed a 3D bioprinted model of osteosarcoma as an alternative model for testing the effects of BNCT. 3D bioprinting is an innovative and attractive technique consisting in depositing, layer-by-layer, a combination of biomaterials and biological components, such as cells, in order to create 3D constructs that can be used for biological and pharmacological tests and studies, among other things. The choice of exploiting a 3D model for our studies comes from the fact that these models better recapitulate the real complexity of solid tumors in vivo, when compared to 2D models, which is crucial for the development of effective treatments. In addition, this approach, according to the 3Rs principle, can be considered as an alternative method to reduce the use of animals in scientific experimentations. In this project we 3D bioprinted a sodium alginate and gelatin matrix with encapsulated rat osteosarcoma cells (UMR-106 cell line). Several experiments were carried out in order to assess if this model could be suitable for BNCT applications. Since the success of the BNCT mainly depends on the selective accumulation of boron in tumor cells, it is mandatory to quantify the intracellular levels of boron, considering that the presence of the gel could interfere with the measurements. For this reason, we tried to set-up a method for the quantification of boron in the osteosarcoma cells encapsulated in the hydrogel. The neutron autoradiography technique, used for boron concentration measurements and biodistribution analysis in 2D samples, was investigated in order to find out if it could be applied also to the three-dimensional model. Preliminary results demonstrated that the gel interference must be taken into account both in terms of influence on boron uptake by the cells and on the intracellular boron quantification. The increase of the boronated-vector concentration and the possibility of cutting the 3D construct in slices might represent solutions to overcome these problems. These options are currently under investigation. Moreover, we also focused on the optimisation of an already existing printing protocol in order to increase the number of clones and obtain, in shorter time, more colonized constructs, on which testing the effects of the irradiation. The results obtained are encouraging and evidence that the optimised protocol can be proper to bioprint 3D models suitable for experimental BNCT applications.

L'osteosarcoma è il tumore osseo maligno primitivo più comune che colpisce bambini e adolescenti. Nonostante l'introduzione di diverse opzioni di trattamento, l'osteosarcoma rimane ancora una sfida da trattare e curare, a causa della sua crescita infiltrativa che porta ad un'alta incidenza di metastasi e, quindi, a bassi tassi di sopravvivenza. Per questo motivo, la Terapia per Cattura Neutronica del Boro (BNCT), una radioterapia binaria sperimentale, è stata studiata come trattamento alternativo o integrativo ai trattamenti convenzionali. La BNCT si basa sull’irraggiamento con neutroni termini di cellule neoplastiche precedentemente arricchite con un isotopo stabile non radioattivo del boro (10B). La successiva reazione di cattura dei neutroni nel boro rilascia due particelle ionizzanti che dissipano tutta la loro energia in una distanza paragonabile al diametro di una cellula, causando danni non riparabili al DNA e fornendo così un modo per distruggere selettivamente le cellule cancerose risparmiando le cellule normali circostanti. Nello specifico, in questo studio abbiamo realizzato un modello di osteosarcoma mediante 3D bioprinting, come modello alternativo per testare gli effetti della BNCT. Il 3D bioprinting è una tecnica innovativa e attraente che consiste nel depositare, strato dopo strato, una combinazione di biomateriali e componenti biologiche, come cellule e fattori di crescita, al fine di creare costrutti 3D che possano essere utilizzati per test e studi biologici e farmacologici. La scelta di sfruttare un modello 3D per i nostri studi deriva dal fatto che questi modelli rappresentano meglio la reale complessità dei tumori solidi in vivo, rispetto ai modelli 2D, aspetto fondamentale per lo sviluppo di trattamenti efficaci. Inoltre, questo approccio, secondo il principio delle 3R, può essere considerato come un metodo alternativo per ridurre l'uso di animali nelle sperimentazioni scientifiche. In questo progetto abbiamo stampato in una matrice 3D di alginato di sodio e gelatina delle cellule di osteosarcoma di ratto (linea cellulare UMR-106). Su questo modello sono stati condotti diversi esperimenti per valutare se potesse essere adatto alle applicazioni di BNCT. Poiché il successo della terapia dipende principalmente dall'accumulo selettivo di boro nelle cellule tumorali, è fondamentale quantificare i livelli intracellulari di boro, considerando che la presenza del gel potrebbe interferire con le misurazioni. Per questo motivo, abbiamo cercato di mettere a punto un metodo per la quantificazione del composto borato nelle cellule di osteosarcoma incapsulate nell'hydrogel. La tecnica dell' autoradiografia neutronica, utilizzata per misurare la concentrazione e la bio-distribuzione del boro in campioni 2D, è stata presa in considerazione per valutare se potesse essere applicata anche al modello tridimensionale. I risultati preliminari hanno dimostrato che l'interferenza del gel deve essere tenuta in considerazione per la sua influenza sia sull'assorbimento del boro da parte delle cellule nel gel che sulla possibilità di quantificare il boro intracellulare. In quest'ultimo caso, l'aumento della concentrazione del vettore borato e la possibilità di tagliare in sezioni sottili il costrutto 3D potrebbero essere possibili soluzioni per superare il problema. Queste opzioni sono attualmente oggetto di studio. Ci siamo inoltre concentrati anche sull'ottimizzazione di un protocollo di stampa già esistente al fine di aumentare il numero di cloni ed ottenere in tempi più brevi costrutti più colonizzati, sui quali testare gli effetti dell'irradiazione. I risultati ottenuti sono incoraggianti e dimostrano che tale ottimizzazione porta alla realizzazione modelli 3D idonei ad applicazioni sperimentali di BNCT.