Caratterizzazione della regolazione dell’espressione a livello post-trascrizionale di MSF (Migration Stimulating Factor) nei macrofagi umani e murini

I macrofagi sono cellule del sistema immunitario caratterizzate da un’elevata capacità di adattarsi a diversi microambienti tissutali: in base alle molecole di segnalazione a cui sono sottoposti, sono infatti in grado di acquisire un fenotipo pro-infiammatorio (macrofagi M1) o anti-infiammatorio (macrofagi M2). I macrofagi M2 sono una componente cellulare importante nella riparazione dei tessuti e possono svolgere funzioni direttamente correlate alla progressione tumorale. Evidenze sperimentali hanno dimostrato l’esistenza di diversi geni upregolati nella polarizzazione M2, tra cui il gene FN1 codificante la fibronectina e MSF, trascritto originato da un evento di poliadenilazione intronica alternativa a livello dell’introne 13 di FN1. Il trascritto codifica per una proteina tronca, inizialmente identificata nei fibroblasti fetali e tumorali come fattore motogenico. Studi successivi nei fibroblasti fetali hanno individuato una seconda isoforma di MSF caratterizzata da una 3’UTR (3’Untranslated Region) più lunga e da una diversa localizzazione subcellulare. A livello murino, non sono state ancora riportate evidenze dell’espressione di MSF. Scopo di questa tesi è stato studiare la regolazione post-trascrizionale di MSF a livello dei macrofagi umani polarizzati M2, utilizzando una combinazione di tecniche molecolari in grado di caratterizzare accuratamente l’espressione dei trascritti in grado di generare MSF. Parte del lavoro di tesi si è inoltre focalizzata sull’identificazione del putativo trascritto murino di MSF. La nostra analisi ha innanzitutto confermato, mediante 3’RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), l’esistenza dell’isoforma corta di MSF nei macrofagi umani, individuando inoltre una seconda isoforma caratterizzata da una 3’UTR, ma di lunghezza differente rispetto a quella descritta in letteratura. Successivamente è stato caratterizzato il profilo di espressione del gene FN1 e dei trascritti di MSF in diversi tessuti umani e nei macrofagi M0, M1 e M2. Mediante esperimenti di real-time RT-PCR è stato possibile evidenziare una upregolazione dei livelli di espressione di FN1 e di MSF nei macrofagi M2 rispetto ai macrofagi M0 e M1 (con aumento quantificabile fino a 4 volte). Saggi di digital PCR hanno inoltre permesso di quantificare l’espressione dell’isoforma corta, che risulta essere il 22% rispetto alla totalità dei trascritti di MSF negli M0, mentre nei macrofagi M2 raggiunge il 44%. Sono stati effettuati inoltre esperimenti di separazione nucleo/citoplasma per valutare l’espressione e la localizzazione delle due isoforme di MSF. Gli esperimenti condotti sull’uomo sono stati replicati nel topo permettendo, per la prima volta, l’individuazione di due isoforme murine di MSF e una caratterizzazione del profilo di espressione in diversi tessuti. In particolare, è emersa una diversa regolazione dei trascritti Fn1 e MSF nella polarizzazione dei macrofagi murini rispetto a quelli umani. Nello specifico, non è stato riscontrato un incremento dell’espressione di Fn1 e MSF nella transizione da un fenotipo M0 a un fenotipo M2. Infine, sono stati individuati RNA circolari potenzialmente in grado di influenzare l’espressione di MSF. In conclusione, questo lavoro di tesi ha permesso di caratterizzare l’espressione delle isoforme di MSF a livello della polarizzazione dei macrofagi umani e murini; i dati ottenuti potranno essere utilizzati per mettere a punto strategie di silenziamento al fine di valutare il possibile coinvolgimento di MSF nel contesto tumorale.