COVID-19: un nuovo strumento quantitativo per la diagnosi, il controllo dell’epidemia e il monitoraggio immunologico

Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a pandemic disease caused by SARS-CoV-2, that caused >80 million infections so far. Accurate diagnosis is critical for achieving control of COVID-19 spread; to date, molecular tests detecting viral RNA are the golden standard for the diagnosis of SARS-CoV2 infections. However, serological tests detecting specific antibody against SARS-CoV2 could contribute to diagnosis in individuals never tested by molecular analyses. Furthermore, quantitative tests could contribute to a better evaluation of the immune response in individuals exposed to- and/or vaccinated against- SARS-CoV2 Currently, most of the developed immunological tests are qualitative or semi-quantitative, and do not provide accurate information about the antibody titre. In this context, we worked on the development of a novel quantitative serological test for the detection of IgG and IgM anti-SARS-CoV2. The assay is based on a recombinant fusion protein containing epitopes from different viral antigens, in combination with chimeric human IgG and IgM antibodies, as calibrators. During the setting up of the test, several analytical parameters were optimized to improve analytical and diagnostic performances. The developed ELISA showed high sensitivity (LoDIgM<0,5ng/mL, LoD IgG<2ng/mL; LoQIgM<2ng/mL LoQIgG<10ng/mL), linearity (20,000.00-1.28 ng/mL; R2>0.99), robustness, and precision (Intra-Assay CV<5%, Inter-Assay CV <13% for both Igs). The assay has been used to test a cohort of 300 serum samples (≈200 from COVID-19 patients and ≈100 from control subjects). The cut-off values for both Igs have been calculated by means of ROC analysis that also allowed the evaluation of assay accuracy (AUC IgM 0.9163 and AUC IgG 0.9964). Overall, the obtained data indicate that the assay ensures high specificity (IgG = 100%, CI 96.5-100; IgM = 100%, CI 95.74-100) and sensitivity (IgG = 93.6%, CI 89.6-96.2; IgM = 93.8%, CI 71.7-99.7). Interestingly, during the validation phase, emerged that asymptomatic patients had lower levels of antibodies than mild-severe cases, and that IgG contents progressively decrease in the first sample group. In conclusion, this thesis work has been focused on the development of a new, quick and reliable antibody detection kit that could be a valuable support to diagnosis, pandemic surveillance, and assessment of immunological response to the on-going vaccination campaign.

Il COVID-19, acronimo dell'inglese COronaVIrus Disease 19, è una malattia pandemica causata dal SARS-CoV2 virus, che fin ora ha causato l’infezione di più di >80 milioni di individui. Una diagnosi accurata è importante per poter controllare il COVID-19; ad oggi, i test molecolari che rilevano l’RNA virale sono considerati il golden standard per la diagnosi delle infezioni di SARS-CoV2. Ciò nonostante, i test sierologici che rilevano la risposta anticorpale specifica contro il SARS-CoV2 possono contribuire alla diagnosi e all’identificazione di individui esposti al virus, anche se senza una pregressa indagine molecolare. I test sierologici quantitativi, inoltre, possono contribuire a monitorare più accuratamente la risposta immunitaria nei soggetti esposti al virus e/o sottoposti a vaccinazione. Attualmente, la maggior parte dei test immunologici sviluppati offre un’analisi di tipo qualitativo o semi-quantitativo e non forniscono informazioni accurate riguardo la concentrazione di anticorpi circolanti. Con queste premesse, abbiamo lavorato allo sviluppo di un nuovo test sierologico quantitativo per la rilevazione delle IgG e IgM anti-SARS-CoV2. Il test immunoenzimatico sviluppato si basa sull’impiego di una proteina di fusione contenente epitopi derivanti da diversi antigeni virali, in combinazione con anticorpi chimerici umani IgG e IgM, usati come calibratori. Nella fase di definizione del protocollo di analisi, sono stati considerati molteplici parametri al fine di migliorarne le performances analitiche e diagnostiche. Il test sviluppato mostra alte sensibilità (LoDIgM<0,5ng/mL, LoD IgG<2ng/mL; LoQIgM<2ng/mL LoQIgG<10ng/mL), linearità (20,000.00-1,28 ng/mL, R2>0,99 per entrambe le Ig), robustezza e precisione (Intra-Assay CV<5% per entrambe le Ig; Inter-Assay CV<13% per entrambe le Ig). Il test è stato utilizzato per analizzare una coorte di oltre 300 campioni di siero (≈200 provenienti da pazienti COVID-19 e ≈100 da soggetti di controllo). I valori di cut-off per la definizione dei soggetti positivi e/o negativi per le IgM e le IgG sono stati stabiliti utilizzando l’analisi ROC, che ha fornito anche indicazioni circa l’accuratezza del test (AUCIgM 0.9163 AUC IgG 0,9964). I dati ottenuti finora dimostrano che il saggio assicura alta specificità (IgG=100%, CI 96.5-100; IgM = 100%, CI 95.74-100) e sensibilità diagnostica (IgG = 93.6%, CI 89.6-96.2; IgM = 93.8%, CI 71.7-99.7). Durante la fase di validazione del test è emerso anche che i pazienti asintomatici hanno un minore livello di anticorpi rispetto ai pazienti con sintomi moderati o severi, e che nel primo gruppo di pazienti, i livelli di IgG diminuiscono più rapidamente. In conclusione, il presente lavoro di tesi, è stato incentrato sullo sviluppo di un test innovativo, rapido e affidabile che potrà servire da supporto alla diagnosi, al controllo dell’epidemia e agli studi immunologici sugli effetti della campagna vaccinale recentemente avviata.