Alterazioni funzionali delle cellule di Müller: possibili implicazioni nella retinopatia diabetica

The goal of this thesis is to characterize the functional changes in Müller cells under experimental conditions that mimi the typical alterations of diabetic retinopathy (DR), for a better comprehension of their role in the pathogenesis of the disease. DR is a complication of both diabetes type I and type II; it is a multifactorial pathology that can become debilitating, as it can cause blindness in the affected patients. The DR pathology has been historically considered a microvascular disorder, and in fact its main diagnostic markers are represented by vascular lesions; however, recent data show a neurodegenerative component, which can appear even before the microvascular symptoms. The Müller cells are the most numerous macroglia cells commonly found in the neuroretina; they have the peculiarity to span the entire thickness of the retina and to be interposed between retinal neurons and blood vessels, therefore providing structural and metabolic support to the neurons and photoreceptors. In addition to their important contribution to the retinal physiology, the Müller cells take part in the inflammatory process, which characterizes DR pathogenesis and contributes to neurodegeneration. Indeed, it has been demonstrated that hyperglycaemic conditions promote the activation of Muller cells, which, in turn, release cytokines, chemokines and trophic factors that can amplify the retinal damage. In this project, a rat cell line of Müller cells (rMC-1) was used; rMC-1 cells were maintained in high glucose-containing medium for 48 hours, to mimic the hyperglicaemic conditions typical of DR. Cell-based assays, biochemical analyses and single-cell imaging were performed to investigate their functional changes under inflammatory and oxidative stress conditions, typically observed in DR cases. In order to mimic DR inflammation, rMC-1 cells were treated for 24h with a mix of proinflammatory cytokines (IL1beta, INF-gamma, NGR-TNF). rMC-1 cells appeared to respond to high glucose with a higher proliferation rate compared to control cells (i.e. maintained in normal glucose concentration), therefore mimicking the gliosis phenomenon observed in in vivo models. Moreover, when rMC-1 cells were subjected to both high glucose and cytokine treatments, they had significant higher activation responses than control cells. Indeed, the former showed higher expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS; analyzed by Western Blot and SDS-page) and higher release of nitric oxide (evaluated with a Griess assay). Besides the damages caused by the nitric oxide, rMC-1 cells can contribute to the retinal disfunction with other mechanisms: they respond to oxidative conditions by producing, in turn, more reactive oxygen species (ROS). This increase of ROS was associated to lower levels of reduced glutathione (GSH), indicating a depletion of the GSH pool due to oxidative conditions. Therefore, the ability of Müller cells to provide glutathione to neurons could be altered, and the oxidative neuronal damage could be amplified. These in vitro results showed some pathogenetic characteristics of Müller cells in conditions that mimic the alterations of DR and open to futures studies aimed to identify the molecular pathways involved and to make the Müller cells potential targets of therapeutical strategies.

Lo scopo di questo lavoro di tesi è la caratterizzazione delle alterazioni funzionali delle cellule di Müller in condizioni sperimentali che possano mimare quelle della retinopatia diabetica (RD) al fine di comprenderne il coinvolgimento nella patogenesi della patologia. La RD è la complicanza più comune del diabete mellito sia di tipo I che di tipo II. La RD è una patologia multifattoriale fortemente invalidante, in quanto può progredire fino a causare cecità nei soggetti affetti. La patologia è stata storicamente considerata come disordine microvascolare; infatti i principali marker diagnostici sono proprio le lesioni vascolari. In realtà, recenti studi hanno mostrato che la RD ha un’importante componente neurodegenerativa, che può anche precedere la comparsa dei sintomi microvascolari. Le cellule di Müller sono una popolazione macrogliale caratteristica della neuroretina; esse hanno la peculiarità di attraversare l’intero spessore retinico e di essere in contatto sia con i neuroni che con i vasi sanguigni, fornendo supporto strutturale e metabolico ai neuroni e ai fotorecettori. Le cellule di Müller sono inoltre implicate nei processi infiammatori che caratterizzano la RD e contribuiscono quindi alla sua patogenesi. È stato infatti dimostrato che condizioni di iperglicemia promuovano una attivazione delle cellule gliali che, rilasciando a loro volta citochine, chemochine e fattori trofici, sembrano contribuire all’ampliamento del danno retinico. In questo progetto è stata utilizzata una linea cellulare di cellule di Müller di ratto (rMC-1), mantenute in un medium ad alta concentrazione di glucosio per mimare le condizioni iperglicemiche tipiche del diabete, che sono in grado di causare infiammazione e stress ossidativo. Le cellule sono state studiate tramite saggi cellulari, analisi biochimiche e di imaging su singola cellula, anche in condizioni pro-infiammatorie ed ossidative. Per mimare queste condizioni infiammatorie tipiche della RD, le cellule di Müller venivano trattate per 24h con una mix di citochine pro-infiammatorie (IL-1beta, ING-gamma, NGR-TNF). Le cellule rMC-1 si sono mostrate in grado di rispondere all’elevata concentrazione di glucosio con una maggiore proliferazione, come è stato descritto per le cellule di Müller primarie e come avviene in vivo, dove si osservano fenomeni di gliosi. Quando le rMC-1 venivano sottoposte contemporaneamente a condizioni di alto glucosio e mix di citochine, avevano una maggiore risposta in termini di attivazione rispetto alle cellule di controllo (mantenute in normali livelli di glucosio). Le prime mostravano infatti un maggior rilascio di ossido nitrico, valutato tramite la reazione di Griess ed una più elevata espressione dell’ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS), analizzata tramite Western Blot-SDS-page. Oltre ai danni causati dall’ossido nitrico, le cellule rMC-1 possono contribuire alla disfunzione della retina poiché aumentano lo stress ossidativo; infatti, se attivate, rispondono a condizioni ossidative producendo a loro volta maggiori livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Inoltre, questa maggiore produzione di ROS era associata a più bassi livelli di glutatione ridotto; potrebbe quindi essere alterata la capacità delle cellule di Müller di fornire glutatione ai neuroni della retina, che risulterebbero quindi più suscettibili ai danni ossidativi. In conclusione, i risultati ottenuti hanno permesso di osservare in vitro alcune caratteristiche patogenetiche nelle cellule di Müller sottoposte a condizioni sperimentali che mimino la RD; ulteriori studi, mirati ad identificare i pathways molecolari coinvoliti, permetteranno di porre le basi per rendere le cellule di Müller dei potenziali target terapeutici.