Il canale anionico voltaggio dipendente (VDAC) è una proteina “β-barrel” di circa 30 kDa espresso in forma monomerica nella membrana mitocondriale esterna di tutti gli eucarioti, di cui costituisce il poro principale per il trasporto di metaboliti. Il nome voltaggio-dipendente è dato dalle chiusure parziali della sua struttura dinamica e dalla modesta selettività anionica. Oltre a regolare le funzioni metaboliche ed energetiche dei mitocondri, il VDAC rappresenta un punto di convergenza per diversi segnali di sopravvivenza cellulare e di morte programmata mediati dalla sua interazione con altri ligandi e proteine. Inoltre, il VDAC è coinvolto in processi molecolari di alcune malattie neurodegenerative oltre che in varie tipologie di cancro. In particolare, da alcune ricerche è emerso che, nelle cellule tumorali, l'esochinasi viene overespressa andando ad interagire, e di conseguenza ad inibire, il VDAC, annullandone la relativa funzionalità mitocondriale e incrementando una stimolazione della glicolisi. Alcuni studi hanno evidenziato, la presenza di alcune molecole in grado di inibire l’interazione tra il VDAC e l’esochinasi; in particolare il peptide NHK1, che corrisponde ai primi 11 amminoacidi dell’esochinasi di tipo I umana, ovvero al suo dominio N-terminale. Il lavoro sperimentale descritto in questo elaborato esplica le modalità di espressione, purificazione e cristallizzazione del VDAC1, in particolare è mirato ad osservare da un punto di vista strutturale, attraverso la cristallografia ai raggi X, come il peptide NHK1 interagisce con il VDAC1, cercando in particolare di identificare quali e quanti residui amminoacidici siano coinvolti ed in quale regione. Tali informazioni potrebbero permettere, inoltre, di sviluppare possibili molecole analoghe al peptide NHK1 che siano in grado di competere con l’esochinasi di tipo I per il legame con il VDAC1 e ostacolare lo sviluppo del cancro nell’uomo. A tale scopo è stata applicata la Vapor Diffusion Crystallization e sono state testate circa 1000 condizioni. Le piastre sono state incubate a due temperature differenti, 4°C e 17 °C, ed in entrambi i casi si è potuto osservare la formazione di microcristalli. Tuttavia, trattandosi di strutture troppo piccole, è necessario espandere il range di condizioni, attraverso un processo di ottimizzazione. È probabile, inoltre, che una diminuzione delle concentrazioni di precipitante permetta la crescita di un numero inferiore di cristalli ma con dimensioni significativamente maggiori, quindi idonee per poter essere analizzate con il Sincrotrone.
Espressione e purificazione del canale anionico voltaggio dipendente di tipo 1 (VDAC1) e cristallizzazione del suo complesso con il peptide NHK1
CALABRESE, LINDA
2020/2021
Abstract
Il canale anionico voltaggio dipendente (VDAC) è una proteina “β-barrel” di circa 30 kDa espresso in forma monomerica nella membrana mitocondriale esterna di tutti gli eucarioti, di cui costituisce il poro principale per il trasporto di metaboliti. Il nome voltaggio-dipendente è dato dalle chiusure parziali della sua struttura dinamica e dalla modesta selettività anionica. Oltre a regolare le funzioni metaboliche ed energetiche dei mitocondri, il VDAC rappresenta un punto di convergenza per diversi segnali di sopravvivenza cellulare e di morte programmata mediati dalla sua interazione con altri ligandi e proteine. Inoltre, il VDAC è coinvolto in processi molecolari di alcune malattie neurodegenerative oltre che in varie tipologie di cancro. In particolare, da alcune ricerche è emerso che, nelle cellule tumorali, l'esochinasi viene overespressa andando ad interagire, e di conseguenza ad inibire, il VDAC, annullandone la relativa funzionalità mitocondriale e incrementando una stimolazione della glicolisi. Alcuni studi hanno evidenziato, la presenza di alcune molecole in grado di inibire l’interazione tra il VDAC e l’esochinasi; in particolare il peptide NHK1, che corrisponde ai primi 11 amminoacidi dell’esochinasi di tipo I umana, ovvero al suo dominio N-terminale. Il lavoro sperimentale descritto in questo elaborato esplica le modalità di espressione, purificazione e cristallizzazione del VDAC1, in particolare è mirato ad osservare da un punto di vista strutturale, attraverso la cristallografia ai raggi X, come il peptide NHK1 interagisce con il VDAC1, cercando in particolare di identificare quali e quanti residui amminoacidici siano coinvolti ed in quale regione. Tali informazioni potrebbero permettere, inoltre, di sviluppare possibili molecole analoghe al peptide NHK1 che siano in grado di competere con l’esochinasi di tipo I per il legame con il VDAC1 e ostacolare lo sviluppo del cancro nell’uomo. A tale scopo è stata applicata la Vapor Diffusion Crystallization e sono state testate circa 1000 condizioni. Le piastre sono state incubate a due temperature differenti, 4°C e 17 °C, ed in entrambi i casi si è potuto osservare la formazione di microcristalli. Tuttavia, trattandosi di strutture troppo piccole, è necessario espandere il range di condizioni, attraverso un processo di ottimizzazione. È probabile, inoltre, che una diminuzione delle concentrazioni di precipitante permetta la crescita di un numero inferiore di cristalli ma con dimensioni significativamente maggiori, quindi idonee per poter essere analizzate con il Sincrotrone.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/12979