Il ruolo di polη nel metabolismo dei G4

An accurate DNA replication during the S-phase is fundamental to mantain genomic integrity. During this critical process, replicative forks frequently encounter several obstacles that block their progression. Among them, we find non-B DNA structures such as G4 quartets. G-quadruplex(G4) are complex secondary structures formed by DNA rich in guanines stabilized by Hogsteen hydrogen bonds. Their location is not random and these structures are distributed at the level of functionally important genomic regions like telomeres and promoters involved in the expression of oncogenes. G4 constitute a barrier that poses a challenge for DNA replication and transcription and DNA helicases have been described to help in their resolution Recently, Translesion Synthesis(TLS) DNA polymerases have been found to play a role in replicating past these complex structures . TLS DNA polymerases are specialised enzymes that are characterised by a wider catalytic site than the error-free replicative DNA polymerases(pol delta and pol epsilon). This feature enables them to accommodate damaged bases and distorted templates in their active sites. In human cells, many TLS DNA polymerases belong to the Y-family polymerases which include pol η,pol κ and pol ι. Pol η,in particular, was described as the deficient protein in the variant form of Xeroderma Pigmentosum(XP-V) that leads to the onset of tumors. The silencing of TLS polymerases has been shown to result in sensitivity to G4 stabilizing compounds and polη is able to elongate a G4 containing primer in vitro. Nevertheless, the role of TLS in G4 metabolism is ill defined. The aim of my thesis is to better characterize and understand the functional interactions between polη and G4s and the role of this DNA polymerase in the replication of these complex secondary structures. We show that the levels of G-quadruplex changes in cells depending on the expression of DNA polymerase eta, both in normal conditions and following treatment with pyridostatin (PDS),a small molecule capable of binding and stabilizing G4s. By using a Proximity ligation assay, we also study the binding of polη to G4 DNA level in vivo. Finally, we also show that the protein levels of pol η are modulated by the exposure to PDS suggesting further involvement of this polymerase in G4 metabolism.

Una replicazione accurata del DNA durante la fase S è fondamentale nel mantenimento dell’integrità genomica. Durante questo processo molto critico, le forche replicative incontrano frequentemente ostacoli che ne impediscono la loro progressione. Tra i vari impedimenti che si possono riscontrare, una notevole importanza è da ascrivere alle strutture non-B del DNA come per esempio i quartetti G4. I G quadruplex sono strutture secondarie complesse costituite da DNA ricco in guanina e stabilizzati da legami ad idrogeno del tipo Hogsteen. Tali strutture sono distribuite a livello di regioni ad alta importanza genomica come per esempio i telomeri e promotori coinvolti nell’espressione di oncogeni. I G4 formano una barriera che rappresenta una sfida per la replicazione e la trascrizione del DNA e le DNA elicasi intervengono nella loro risoluzione. Recentemente, è stato dimostrato che le DNA polimerasi TLS svolgono un ruolo importante nella replicazione di queste strutture secondarie complesse. Le TLS polimerasi sono enzimi specializzati che presentano una struttura più ampia del loro sito catalitico rispetto alle normali error-free DNA polimerasi (pol delta ed epsilon),che permette loro di accogliere le basi danneggiate e il filamento stampo distorto nel loro sito attivo. Nelle cellule umane molte TLS polimerasi appartengono alla famiglia delle polimerasi di tipo Y tra cui troviamo polη,polκ e polι. Polη,in particolare, è stata descritta come la proteina mancante nella variante dello Xeroderma pigmentosum(XP-V) che porta all’insorgenza di tumori. E’ stato dimostrato che il silenziamento delle TLS polimerasi risulta in una sensibilità ai composti che stabilizzano i G4 e polη è capace di allungare primer contenenti G4 in vivo. Tuttavia, il ruolo della TLS nel metabolismo dei G4 non è ben definito. L’obiettivo della mia tesi è quello di caratterizzare e capire le interazioni funzionali che intercorrono tra polη e i G4 ed il ruolo di questa DNA polimerasi nella replicazione di tali strutture secondarie complesse. Abbiamo notato un cambiamento nei livelli di G quadruplex in cellule esprimenti e non esprimenti la DNA polimerasi eta, in condizioni normali e in seguito a trattamento con piridostatina(PDS), una molecola capace di legare e stabilizzare i G4. Utilizzando la PLA(Proximity ligation assay), abbiamo studiato l’interazione tra i G4 e la DNA polimerasi eta a livello del DNA in vivo . Alla fine, abbiamo visto che i livelli della polη sono modulati dall’esposizione con PDS suggerendo un ulteriore coinvolgimento di questa polimerasi nel metabolismo dei G4.