Ricostruzione 3D del plesso coroideo in situ nell'encefalo chiarificato di ratto

The choroid plexus (CP), located inside the cerebral ventricles, acts as a regulated gate between blood and cerebrospinal fluid (CSF) . Despite its simple histology (a monostratified cuboidal epithelium overlying a vascularized stroma), there are notable differences in the arrangement of CP fronds and blood vessels between hindbrain and forebrain CPs. Our knowledge of CP vascular organization is mainly derived from resin casts; in addition, transmission electronic microscopy (TEM ) evidenced sporadic contacts of CP fronds to the brain parenchyma [Terr and Edgerton 1985]. The latter may be important, in light of CP roles in neurogenesis and neuroimmunoendocrine communication [Kaiser and Briya 2020]. So far, however, few studies have described CP spatial organization at the mesoscale level, because of its fragile nature and deep location within the brain. Our interest in the study of the CP of the fourth ventricle starts from the observation of its association with the central auditory system, which constitutes the main line of research of our group. The involvement of the CP within the auditory system in normal and pathological conditions has so far been neglected, mainly due to the difficulties related to the study of this structure. Here, using an iDISCO-based clearing approach and light-sheet microscopy [Perin et al. 2019], we have reconstructed the rat hindbrain CP macro-and microstructure, using markers for epithelium, arteries, microvasculature, and macrophages, and noted its association with 4th ventricle-related neurovascular structures. Some CP regions displayed more dispersed fronds, often terminating with “feet” touching the 4th ventricle floor, in particular the dorsal cochlear and vestibular nuclei or cerebellum. Some contacts seem to be preserved between the various individuals, as well as, the presence of particular adhesion proteins that could have a specific role in the formation of contacts seems to be regular and not accidental [Dani et al., 2021; Lun et al., 2015; Lobas et al., 2011]. Regarding vascularization, the microvessel tortuosity follows frond geometry: within each frond a regular bidimensional network is seen. We propose that this preparation is highly suitable for studying vascular connectivity and immune responses in the hindbrain CP in healthy rats and in neuroinflammatory conditions related to cerebellar and auditory/vestibular conditions.

Il plesso coroideo è una struttura secretoria situata all'interno dei ventricoli dell’encefalo, responsabile della produzione di liquido cerebrospinale (CSF) e della barriera emato- liquorale (Lun et al., 2015). Nonostante la sua semplice istologia ad epitelio cuboidale monostratificato sovrastante uno stroma vascolarizzato, la sua fisiologia appare piuttosto complessa, e ci sono notevoli differenze nella geometria e possibile funzione del plesso coroideo del quarto ventricolo, a livello del romboencefalo, rispetto a quello dei ventricoli laterali, a livello del proencefalo. Il nostro interesse allo studio del plesso coroideo del quarto ventricolo a livello del romboencefalo parte dall’osservazione della sua associazione con il sistema uditivo centrale, che costituisce la principale linea di ricerca del nostro gruppo. La nostra conoscenza dell'organizzazione morfologica e vascolare del plesso coroideo deriva principalmente da calchi in resina; inoltre, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha evidenziato contatti sporadici tra le fronde del plesso ed il parenchima cerebrale (Terr e Edgerton, 1985). Quest'ultima osservazione può essere importante, alla luce dei ruoli del plesso nella neurogenesi e nella comunicazione neuroimmunoendocrina (Kaiser e Briya, 2020). Tuttavia, finora pochi studi hanno descritto l'organizzazione spaziale del plesso coroideo a livello di mesoscala (ossia quella scala che consente di osservare dettagli microscopici pur ricostruendo per intero la struttura macroscopica), a causa della sua natura fragile e della sua posizione profonda all'interno del cervello. L’assenza di studi sulle caratteristiche del plesso del quarto ventricolo in situ ci ha portato a concentrare la nostra attenzione sulla struttura normale di quest’organo, la sua distribuzione morfologica all’interno del quarto ventricolo, ed i suoi punti di contatto con i nuclei affacciati alla superficie dell’ependima. In questo studio, utilizzando un approccio di chiarificazione basato sul metodo iDISCO+ e la microscopia light-sheet (Perin et al. 2019), abbiamo ricostruito la macro e la microstruttura del plesso del romboencefalo di ratto, utilizzando marcatori per epitelio, arterie, microcircolo e macrofagi e, successivamente alla ricostruzione tridimensionale delle strutture a partire dalle immagini acquisite con opportuni metodi computazionali, abbiamo notato la sua associazione con le strutture neurovascolari legate al quarto ventricolo, a livello del romboencefalo. I risultati mostrano alcune regioni del plesso coroideo più compatte ed “ordinate” e altre regioni invece “disordinate”, con lunghe fronde irregolarmente ramificate che spesso terminano con "piedi" che toccano il pavimento del quarto ventricolo (in particolare, il nucleo cocleare dorsale e i nuclei vestibolari) o il cervelletto. La posizione complessiva dei contatti sembra conservata tra i vari individui, e la presenza di ponti microscopici suggerirebbe la presenza di proteine di adesione che potrebbero avere quindi un ruolo specifico nella formazione di questi contatti e definire specifiche funzioni (Dani et al., 2021; Lun et al., 2015; Lobas et al., 2011). Per quanto riguarda la vascolarizzazione, la tortuosità del microcircolo segue la geometria delle fronde: all'interno di ciascuna fronda si vede una rete bidimensionale regolare di capillari. Il metodo di chiarificazione ed immunomarcatura qui presentato, con successiva rielaborazione delle immagini ottenute e ricostruzione tridimensionale, si è rivelato adatto per studiare la morfologia, la connettività vascolare e le risposte immunitarie del plesso coroideo del romboencefalo nel ratto sano; l’evoluzione successiva di questo lavoro sarà l’applicazione di questo metodo allo studio delle strutture di interesse in condizioni neuroinfiammatorie legate a patologie cerebellari e uditive/vestibolari.