Produzione in larga scala di AAV associati a vescicole extracellulari, promettenti vettori per la terapia genica Large-scale production of extracellular vesicles-associated AAVs, a promising vector for gene therapy

Over the last years, gene therapy for the treatment of genetic diseases have achieved important goals such as the use of viruses as delivery systems. Among the several viruses investigated, Adeno-associated virus (AAVs) turned out to be one of the most promising and versatile vector that can be engineered to target specific tissues and perform specific functions. Furthermore, it has been shown to be safe and effective both in preclinical studies and clinical trials. However, despite AAVs has been shown to be less immunogenic than other viral vectors such as Adenovirus and Lentivirus, capsid proteins have been reported to trigger various components of immune system. This is further complicated by the fact that 50% of the population has pre-existing adaptive response, as they have already been exposed to AAVs. Moreover, intravenous administration of AAVs mainly results in liver sequestration, which may be a problem when the liver is not the target of the therapy. Another drawback of AAVs is that it can package a smaller transgene compared to Adenovirus and Lentivirus. During standard AAVs production, a portion of AAVs has been reported to be naturally released associated with extracellular vesicles (EVs), which are membranous structures, virtually released by all cell types and shuttling between cells, thereby delivering different signals and messages. EVs are delimited by a lipid bilayer and do not contain a functional nucleus. Association between AAVs and EVs (vectors named as EV-AAVs) could provide great advantages and overcome some of the major limits of standard AAVs (AAVs not associated with EVs) applications. Accordingly, EV-AAVs have been shown to be more resistant to neutralizing anti-AAV antibodies in vitro than standard AAVs. Furthermore, in vivo data revealed that EV-AAV vectors mediate more efficient transduction in the central nervous system (CNS) compared to standard AAVs. The mechanism of enhanced gene transfer has not determined yet, but it might be due to the presence of additional receptors, exposed on the membrane of the vesicle and not present on the viral capsid that facilitate entering the recipient cell. Intrigued by these newly discovered vectors and by their potential, we sought to establish and optimize a large-scale production, purification and characterization of EV-AAVs. In fact, in order to aim at large-animal preclinical studies and following human clinical applications, the ability to produce large amount of EV-AAVs represent a major challenge. Differential ultracentrifugation is the gold standard method for the isolation of EV-AAVs from conditioned medium. However, it is a laborious and time-consuming technique, not suitable for production of large number of vectors. In this work, we demonstrate that functional EV-AAVs can be produced in large-scale culture and isolated through precipitation without affecting their activity in vitro. Our method for EV-AAVs production avoids time-consuming differential ultracentrifugation and includes instead an easy polymeric precipitation approach. Polymeric precipitation has been shown to be efficient for isolation of EVs, therefore we assumed it might be suitable for isolation of EV-AAVs as well. Purified EV-AAVs were characterized with Bicinchoninic acid (BCA) protein assay, Western Blotting, Nanoparticles Tracking Analaysis (NTA) and quantitative Polymerase Chain Reaction (q-PCR) and data showed that precipitation was actually efficient for isolation of EV-AAVs. Once obtained a huge amount of these vectors, we focused on evaluating if they were still functional after precipitation. We transduced Neuro-2a and NIH3T3 cells to test their transfer efficiency in vitro. Data showed that they were able to transfer the transgene with an efficiency comparable and, in some cases, even higher than standard AAVs. We are now moving further with animal experiments to investigate how association with EVs influence distribution and efficiency of AAVs in vivo.

Negli ultimi anni, la ricerca nel campo della terapia genica ha conseguito importanti progressi, tra cui l’utilizzo di virus come vettori per la veicolazione di transgeni. Il trasferimento sicuro ed efficiente dell’acido nucleico nel tessuto bersaglio rappresenta uno dei principali obiettivi da perseguire e la scelta del vettore più adeguato da utilizzare riveste un ruolo fondamentale. Tra i virus studiati, gli adeno-associati (AAVs) sono ritenuti candidati versatili, promettenti, non patogeni per l’uomo e meno immunogenici di altri vettori virali investigati, tra cui gli Adenovirus e Lentivirus. Tuttavia, gli AAVs presentano degli svantaggi che ne limitano l’utilizzo in vivo. In primo luogo, le infezioni da AAVs sono molto frequenti e circa il 50% della popolazione sviluppa, nel corso della vita, anticorpi neutralizzanti. La presenza di tali anticorpi neutralizzanti riduce drasticamente l’emivita del vettore dopo la somministrazione e, conseguentemente, l’efficacia della terapia. Inoltre, è stato osservato che dopo la somministrazione una significativa quantità di AAVs somministrati viene sequestrata dal fegato, impedendo loro di raggiungere l’rogano bersaglio. Oltretutto, gli AAVs possono veicolare acidi nucleici di dimensioni molto minori rispetto ad Adenovirus e Lentivirus. Dati di letteratura dimostrano che, durante la produzione di AAVs, una frazione di essi è rilasciata in associazione con vescicole extracellulari (EVs). Prodotte da quasi tutti i tipi cellulari, le EVs sono vescicole coinvolte nella comunicazione inter-cellulare e svolgono svariati ruoli in meccanismi fisiologici e patologici. L’associazione degli AAVs con le EVs (EV-AAVs) potrebbe conferire significativi vantaggi a questi vettori. In primo luogo, è stato osservato che le EVs proteggono gli AAVs dagli anticorpi neutralizzanti. Inoltre, sembrerebbero aumentare l’efficacia del trasferimento del transgene rispetto agli standard AAVs (AAVs non associati alle EVs). Il ruolo delle EVs nel trasferimento del transgene non è ancora noto, ma è stato ipotizzato che esse forniscano recettori aggiuntivi e facilitino il legame con le cellule bersaglio. Incuriositi da questi nuovi e promettenti vettori, il lavoro di tesi sperimentale si è incentrato sulla messa a punto di un metodo per la produzione in larga scala di EV-AAVs. La premessa per poterli testare in vivo e nell’uomo è, infatti, avere a disposizione un protocollo che consenta di produrne quantità sufficienti. Tuttavia, ad oggi, un protocollo di questo tipo non è disponibile. L’obiettivo del nostro lavoro è stato, dunque, ottimizzare un metodo per la produzione e la purificazione in larga scala di EV-AAVs. La procedura standard per la produzione di questi vettori include l’ultracentrifugazione differenziale, un metodo laborioso e non adatto a grandi quantità di campione da processare. Pertanto, in alternativa all’ultracentrifugazione, abbiamo testato un protocollo di precipitazione polimerica. I vettori virali così purificati sono stati caratterizzati con BCA, Western Blotting, quantitative Polymerase Chain Reaction (q-PCR) e Nanoparticles Tracking Analysis e usati per trasdurre le linee cellulari Neuro-2a e NIH3T3. Una volta accertato che gli EV-AAVs prodotti tramite il protocollo di precipitazione polimerica da noi proposto sono in grado di trasferire il transgene in vitro, è stato progettato un esperimento per studiare la loro efficacia negli animali. L’esperimento ha come obbiettivo quello di investigare il ruolo svolto dalle EVs durante la veicolazione del transgene e capire se essi influenzano, oltre che l’efficacia, la distribuzione di AAVs dopo la somministrazione.