Produzione, purificazione e caratterizzazione biochimico-strutturale del dominio LG2y4 di Agrin.

The neuromuscular junction (NMJ) represents the point of contact between the motor neuron and the muscle fibers, which allows the conversion of an electrical impulse into a mechanical response, a process that is important for all living beings, including humans. The signaling mechanisms that underlie the formation, maintenance, and functioning of this highly specialized structure are many. Among them, one of the most studied and best described is certainly the Agrin-dependent signaling process concerning the induction of acetylcholine receptor (AChR) clustering on the muscle cell membrane. At the level of the neuromuscular junction, Agrin is secreted by the motor neuron into the synaptic cleft where it performs its activity by interacting with its co-receptor located on the muscle cell membrane. This co-receptor is a complex consisting of two transmembrane proteins known as LRP4 (low-density lipoprotein receptor-related protein 4) and MuSK (Muscle-specific Kinase). The interaction between Agrin and its receptor then generates an intracellular signaling cascade that results in cytoskeletal rearrangements and subsequent clustering of acetylcholine receptors on the postsynaptic membrane. The structural organization of Agrin allows to define it as a proteoglycan with a molecular weight of 500 kDa, half of which is attributable to massive post-translational modifications, with the insertion of negatively charged side chains belonging to the group of heparan sulfates (HS) and chondroitin sulfates (CS), which, together with its calcium dependence, seem to modulate its activity. Of great importance for the induction of acetylcholine receptor clustering are the LG2 and LG3 domains, present at the C-terminus. This is due to the fact that the LG3 domain was found, in in vivo tests, to be the minimum useful unit to obtain an observable response and that the presence of the LG2 domain has the effect of enhancing the aforementioned activity. Therefore, the role played by Agrin at the neuromuscular junction is confirmed by the fact that mutations located in different domains, especially at the N- and C-terminal, result in diseases known as congenital myasthenic syndromes, marked by a marked muscle weakness. In this work, a biochemical and structural approach is proposed in order to determine the structure of the LG2y4 domain and its ability to interact and bind calcium. This was carried out using mutant constructs and the analysis of their thermal denaturation profiles in the presence of buffers containing calcium in different concentrations, as well as the production of crystallization trials, in order to obtain protein crystals useful to determine its structure by the technique of X-ray crystallography.

La giunzione neuromuscolare (NMJ) rappresenta il punto di contatto tra il motoneurone e le fibre muscolari, la quale consente la conversione di un impulso elettrico in una risposta meccanica, processo importante per tutti gli esseri viventi, compreso l’uomo. I meccanismi di segnalazione che stanno alla base della formazione, mantenimento e funzionamento di questa struttura altamente specializzata sono molteplici. Tra questi, uno dei più studiati e meglio descritti è sicuramente il processo di segnalazione Agrin-dipendente riguardante l’induzione del clustering dei recettori acetilcolinici (AChR) sulla membrana delle cellule muscolari. A livello della giunzione neuromuscolare, Agrin è secreta dal motoneurone nella fessura sinaptica dove svolge la sua attività interagendo con il proprio co-recettore localizzato sulla membrana delle cellule muscolari. Questo co-recettore è un complesso costituito da due proteine transmembrana conosciute come LRP4 (low-density lipoprotein receptor-related protein 4) e MuSK (Muscle-specific Kinase). L’interazione tra Agrin e il proprio recettore genera quindi una cascata di segnalazione intracellulare che provoca riarrangiamenti citoscheletrici ed il conseguente clustering dei recettori acetilcolinici sulla membrana postsinaptica. L’organizzazione strutturale di Agrin permette di definirla come un proteoglicano dal peso molecolare di 500 kDa, metà del quale è attribuibile a massive modificazioni post-traduzionali, con l’inserimento di catene laterali cariche negativamente appartenenti al gruppo degli eparan solfati (HS) e condroitin solfati (CS), i quali, insieme alla sua dipendenza dal calcio, sembrano modularne l’attività. Di grande rilevanza per l’induzione del clustering dei recettori acetilcolinici, sono i domini LG2 ed LG3, presenti al C-terminale. Questo è dovuto al fatto che il dominio LG3 è risultato, nei test in vivo, la minima unità utile per ottenere una risposta osservabile e che la presenza del dominio LG2 ha come effetto quello di potenziare la suddetta attività. Pertanto, il ruolo svolto da Agrin a livello della giunzione neuromuscolare trova conferma della sua importanza nel fatto che mutazioni localizzate in diversi domini, soprattutto al N- e al C-terminale, si traducono in patologie conosciute come Sindromi miasteniche congenite, contrassegnate da una marcata debolezza muscolare. In questo elaborato, viene proposto un approccio biochimico e strutturale, al fine di determinare la struttura del dominio LG2y4 e la sua capacità di interagire e legare il calcio. Questo è stato svolto mediante l’ausilio di costrutti mutanti e l’analisi dei loro profili di denaturazione termica in presenza di buffer contenenti il calcio in diverse concentrazioni, oltre alla produzione di trial di cristallizzazione, al fine di ottenere cristalli di proteina utili a determinarne la struttura mediante la tecnica di cristallografia ai raggi X.