Espressione e purificazione della tossina peptidica ricombinante Hanatoxin 1

Toxins produced by animals such as spiders, snakes, and scorpions, whose main function is to defend or kill the prey, is a rich source of proteins, peptides, and small molecules; in particular, peptides, which are rich in disulfide bonds, are the main component of most animal venoms. In recent years, these peptides have been studied with the aim of identifying possible therapeutic agents, given their mechanism of action that selectively targets a wide range of neuronal receptors and ion channels. The extraction of these venom toxins directly from the animals is complicated and has a low yield. Therefore, the expression of these toxins by the recombinant DNA technology has been investigated, and it allowed to obtain an adequate amount of purified toxins to be used for experiments at the molecular and cellular level. To this point, Escherichia coli (E. coli) represents the most widely used heterologous expression system, in which recombinant proteins are usually accumulated in the cytoplasm of the bacterium. However, because many animal toxins contain disulfide bonds, they tend to be misfolded and aggregated when in the reducing cytoplasm of E. coli. In contrast, conditions in the periplasm of the bacterium allow for the formation of disulfide bonds and proper folding of these toxins. Hanatoxin 1 (HaTx1) is a polypeptide toxin from the tarantula Grammostola spatulata rosea, first isolated from spider venom during a search targeted at finding voltage-dependent potassium channel inhibitors. The present study aims to recombinantly produce this toxin, using an expression system that allows to maintain the native structure by periplasmic expression, and then its purification.

Le tossine prodotte da animali come ragni, serpenti, e scorpioni, il cui scopo principale è quello di difendersi o uccidere le prede, è una fonte ricca di proteine, peptidi e piccole molecole; in particolare i peptidi, ricchi di ponti di solfuro, sono il componente dominante della maggior parte dei veleni animali. Negli ultimi anni, proprio questi peptidi sono stati oggetto di studio con l’obiettivo di sviluppare possibili agenti terapeutici, dato il loro meccanismo di azione che prende di mira una vasta gamma di recettori neuronali e di canali ionici in modo selettivo. L’estrazione di questi veleni direttamente dagli animali che li producono è complicata e ha una bassa resa; si è quindi approfondita l’espressione di queste tossine per via ricombinante, che permette di ottenere una quantità di queste proteine adeguata per poter essere utilizzate per esperimenti a livello molecolare e cellulare. Ad oggi, Escherichia coli (E. coli) rappresenta il sistema di espressione eterologa più utilizzato, in cui le proteine ricombinanti sono solitamente accumulate nel citoplasma del batterio. Tuttavia, poiché molte tossine animali contengono legami disolfuro, esse tendono ad essere mal ripiegate e aggregate quando si trovano nel citoplasma riducente dell'E. coli. Al contrario, le condizioni nel periplasma del batterio permettono la formazione di legami disolfuro e il corretto ripiegamento di tali tossine. Hanatoxin 1 (HaTx1) è una tossina polipeptidica della tarantola Grammostola spatulata rosea, isolata per la prima volta dal veleno del ragno, durante una ricerca mirata a trovare inibitori del canale voltaggio-dipendente del potassio. Il presente studio intende produrre per via ricombinante questa tossina, utilizzando un sistema di espressione che permetta di mantenere la struttura nativa tramite espressione periplasmatica, e successivamente la sua purificazione.