Molecular validation of bioinformatically-characterised endogenous viral elements of arboviral vectors

The most common viruses that infect humans, and include epidemiologically relevant viruses such as the influenza, Ebola, chikungunya and West Nile viruses, are nonretroviral RNA viruses (NRVs), meaning viruses with an RNA-based genome that lacks the machinery needed for integration into host genomes. Because of this property, several species of NRVs are used in gene therapy applications as delivery systems for drugs and vaccines. As a consequence, the recent finding of sequences from NRVs integrated into animal and plant genomes came as a shocking surprise to the scientific community, a discovery that the virologist Edward Holmes calls “one of the most remarkable observations in viral evolution of recent years”. The widespread of this phenomenon, its mechanisms and the biological significance of these nonretroviral endogenous viral elements (nrEVEs) in host genomes are still largely unknown. NRVs include epidemiologically relevant viruses such as Dengue, Chikungunya and Zika viruses, which are transmitted to humans by the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes albopictus. There are no arbovirus-specific drugs and vaccines are limited, thus prevention of arboviral diseases lays on control of the arthropod vectors. Historical methods of vector control such as the use of insecticides and environmental control are facing challenges due to the wide spread of insecticide resistance throughout natural mosquito populations and the complexity of breeding site elimination in the modern urban environment. Selected nrEVEs have been recently shown to limit cognate viral infections, suggesting they are novel antiviral effectors and could be used in novel genetics-based strategies of vector control. However, the mechanism through which nrEVEs are formed is still poorly understood. nrEVEs are primarily found embedded within transposable elements (TEs) in piRNA clusters and produce piRNAs. Additionally, upon mosquito infection, NRVs produce DNA fragments, vDNA, which appear to be associated with TEs. These results suggest that TEs can contribute to integration and that nrEVEs are regulated through the piRNA pathways as TEs. A corollary of this observation, is that the landscape of nrEVEs should be different in the genomes of wild mosquito populations depending on their past viral exposure. In this experimental thesis, I contributed to molecularly validate nrEVEs that were bioinformatically-identified in the genomes of wild-collected Aedes aegypti and Aedes albopictus mosquitoes, demonstrating that the pattern of nrEVEs differs among geographic populations and is consistent with the different origin and the invasion history of the two species.

Validazione molecolare di sequenze di origine virale identificate bioinformaticamente nel genoma di vettori di arbovirus. I virus più comuni che infettano gli esseri umani, e comprendono virus epidemiologicamente rilevanti come virus Ebola, chikungunya e West Nile, sono virus a RNA non retrovirale (NRV), cioè virus con un genoma a RNA che manca del meccanismo necessario per l'integrazione nei genomi dell'ospite. A causa di questa proprietà, diverse specie di NRV sono utilizzate in applicazioni di terapia genica come vettori per farmaci e vaccini. Di conseguenza, la recente scoperta di sequenze di NRV integrate in genomi animali e vegetali è stata una sorpresa scioccante per la comunità scientifica, una scoperta che il virologo Edward Holmes definisce "una delle osservazioni più notevoli nell'evoluzione virale degli ultimi anni". La diffusione di questo fenomeno, i suoi meccanismi ed il significato biologico di questi elementi virali endogeni non retrovirali (nrEVEs) nei genomi degli ospiti sono ancora in gran parte sconosciuti. Gli NRV includono virus epidemiologicamente rilevanti come i virus Dengue, Chikungunya e Zika, che sono trasmessi all'uomo dalle zanzare Aedes aegypti e Aedes albopictus. Non ci sono farmaci specifici per gli arbovirus ed i vaccini sono limitati, quindi la prevenzione delle malattie arbovirali si basa sul controllo degli artropodi vettori. I metodi storici di controllo dei vettori come l'uso di insetticidi e il controllo ambientale sono minacciati dell'ampia diffusione della resistenza agli insetticidi nelle popolazioni naturali di zanzare e dalla complessità dell'eliminazione dei siti di riproduzione nell'ambiente urbano moderno. Recentemente è stato dimostrato che alcuni nrEVEs limitano successive infezioni virali, suggerendo che gli nrEVEs sono effettori antivirali e potrebbero essere utilizzati in nuove strategie per il controllo dei vettori basate sulla manipolazione genetica. Il meccanismo attraverso il quale si formano nrEVEs è ancora poco compreso. Nel genoma delle zanzare, gli nrEVEs si trovano principalmente a fianco di elementi trasponibili (TE), in cluster di piRNA e producono piRNA. Inoltre, dopo aver infettato una zanzara, gli NRVs producono frammenti di DNA, vDNA, fiancheggiati da sequenze di TE. Questi risultati suggeriscono che i TE possono contribuire all'integrazione e che gli nrEVE sono regolati attraverso il piRNA pathway come i TE. Un corollario di questa osservazione è che l’array degli nrEVEs nei genomi delle popolazioni di zanzare selvatiche dovrebbe variare a seconda della loro passata esposizione virale. In questa tesi sperimentale, ho contribuito a convalidare molecolarmente i nrEVE identificati bioinformaticamente nei genomi delle zanzare Ae. aegypti e Ae. albopictus raccolte in natura dimostrando un diverso pattern di distribuzione degli nrEVEs, che è coerente con l’origine e la storia di invasione delle due specie di zanzara.