Generazione di mutanti per la sintesi di cheto-carotenoidi non endogeni nei cianobatteri Synechococcus elongatus PCC 7942 e Chroococcidiopsis thermalis PCC 7302

This thesis is part of a larger project that has the objective to study several species of microalgae and cyanobacteria, and to investigate technical and biomolecular aspects that can be useful for their use in biotechnological and industrial applications. Cyanobacteria are the most adaptable phototrophic organisms thanks to their simple growth requirements and to the availability of several established genetic tools. The model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 is the most used strain as a “cell factory” but for future further applications it would be beneficial to explore the use of other species with useful chemical and biological characteristics. This work focuses on two cyanobacteria species in particular: Synechococcus elongatus PCC 7942, which is a model organism for the study of circadian rhythms in cyanobacteria and is known to have high transformation efficiency and high growth rates and Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203, which is a very interesting cyanobacterium not only because of its high resistance to different stress conditions, but also because of its ability to perform the FaRLiP (Far-Red Light Photoacclimation) response that allows it to grow in peculiar light conditions (far-red wavelength enriched light), which are limiting for other cyanobacteria. Even with all the advantages of the use of cyanobacteria for industrial applications, at present the process is economically not fully sustainable. A promising strategy to raise the efficiency of microalgae cultivation is to couple already optimized and efficient biotechnological processes (like the production of biofuels) with the production of value-added compounds like carotenoids. In particular, Astaxanthin (Asx) and Cantaxanthin (Can), which are the hydroxylated and ketolated derivatives of β-carotene, are very useful metabolites that have various applications in the cosmetic, pharmaceutical and nutraceutical industries. S. elongatus PCC 7942 and C. thermalis PCC 7203 are not able to accumulate these keto-carotenoids because they do not possess the necessary enzymes for their synthesis. The objective of this work, therefore, is to insert in these organisms the genes CrtW (β-carotene ketolase) and CrtZ (β-carotene hydroxylase) that are necessary for keto-carotenoids biosynthesis, generating engineered strains (mutants). The plan is to insert these genes singularly and in tandem using biparental mating (Escherichia coli-cyanobacteria). To this end, pFC1 plasmids, carrying the sequences of CrtW and CrtZ (optimised for the expression in cyanobacteria) from the marine bacterium Brevundimonas sp. SD-212, are used. pFC1 is an expression vector constructed for the use in cyanobacteria that allows the temperature-controlled expression of the genes cloned into it. The screening of the mutants obtained with this procedure occurs by PCR (polymerase chain reaction) in order to verify if the genes of interest are present. Positive colonies are then grown in liquid to perform the induction test. The induction of exogenous gene expression is carried out by raising the growth temperature to 33°C and maintaining it for a few days. The extent of keto-carotenoids accumulation is then determined by analysing and comparing the absorption spectra of the pigments extracted from the induced and non-induced mutants as well as with the wild type strain.

Questo lavoro di tesi fa parte di un progetto di ricerca molto più ampio, che ha come obiettivo quello di studiare alcune specie di microalghe e cianobatteri e di ricercare gli aspetti tecnico-scientifici e biomolecolari necessari al loro utilizzo in ambito biotecnologico ed industriale. I cianobatteri sono tra gli organismi fototrofi più adattabili grazie ai loro requisiti di crescita modesti e a tools genetici disponibili e testati. In questo senso è soprattutto il cianobatterio modello Synechocystis sp. PCC 6803 la specie più utilizzata come “cell factory”; ma in prospettiva sarà necessario esplorare l’utilizzo di altre specie con caratteristiche utili dal punto di vista chimico-fisico e biologico in previsione di una loro futura applicazione. Questo lavoro si concentra su due specie qui brevemente descritte. Synechococcus elongatus PCC 7942 è un organismo modello per lo studio dei ritmi circadiani nei cianobatteri ed è noto per avere un’alta efficienza di trasformazione e ritmi di crescita elevati. Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203 invece, è una specie molto interessante non solo per la sua capacità di resistenza a diverse condizioni di stress, ma anche per la peculiarità di avere nel suo patrimonio genetico il cluster FaRLiP (Far-Red Light Photoacclimation) che gli permette di crescere anche in condizioni di luce particolari (luce arricchita nelle lunghezze d’onda del rosso lontano), normalmente non praticabili per altri cianobatteri. Nonostante i numerosi vantaggi che deriverebbero dall’utilizzo dei cianobatteri in ambito industriale, al momento il processo non è ancora economicamente efficiente e una strategia promettente per aumentare il rapporto costi-benefici, consiste nell’accoppiare processi biotecnologici già ottimizzati ed efficienti (come ad esempio la produzione di biocarburanti) con la produzione di molecole ad alto valore aggiunto, quali ad esempio i carotenoidi. In particolare, astaxantina (Asx) e canthaxantina (Can), derivati idrossilati e chetolati del β-carotene, sono metaboliti molto utili che possiedono svariate applicazioni nel settore alimentare, farmaceutico e cosmetico. I ceppi di cianobatteri sopra menzionati non sono in grado di accumulare naturalmente questi cheto-carotenoidi perché non possiedono gli enzimi necessari per la loro sintesi. Lo scopo del lavoro è perciò quello di inserire all’interno di questi organismi i geni CrtW (β-carotene chetolasi) e CrtZ (β-carotene idrossilasi) necessari per la sintesi dei cheto-carotenoidi Asx e Can generando dei ceppi ingegnerizzati (mutanti). La strategia sperimentale prevede quindi l’inserimento dei geni CrtW e CrtZ, sia singolarmente che in tandem, tramite coniugazione biparentale (Escherichia coli – cianobatterio), utilizzando quattro costrutti distinti. I costrutti sono stati ottenuti partendo dalle sequenze geniche di CrtW e CrtZ del batterio marino Brevundimonas sp. SD-212, ottimizzate per l’espressione nei cianobatteri, e clonate nel plasmide pFC1. Questo è un vettore di espressione condizionale progettato per l’utilizzo nei cianobatteri e permette l’espressione regolata dalla temperatura dei geni clonati al suo interno. I mutanti ottenuti con questo procedimento vengono testati tramite PCR per la presenza dei geni di interesse e se il risultato è positivo si procede alla crescita in liquido e alle prove di induzione. L’induzione dell’espressione dei geni esogeni viene effettuata alzando la temperatura di crescita a 33°C e mantenendola costante per alcuni giorni. L’eventuale produzione di cheto-carotenoidi viene valutata analizzando gli spettri di assorbimento dei pigmenti estratti dai mutanti indotti e dal confronto con i mutanti non indotti e col ceppo selvatico.