Cloning, expression and purification of the human Hexokinase 1 and the human Voltage Dependent Anion Channel 1. An analityc approach for their interaction and protein – protein complex isolation.

Hexokinase is the first enzyme of the aerobic glucose catabolism, glycolysis, in which it catalyses the phosphorylation of glucose, through hydrolysis of ATP, into glucose-6-phosphate (G6P). The isoform HK-I is a 108 kDa cytosolic protein formed by a single polypeptide chain composed of 917 amino acids and divided into the N-terminus (residues 1–474) and the C-terminus (475– 917). The regulatory function of HK-I is characteristic of the N-terminal domain. The catalytic one is carried out by the C-terminal domain, which has two distinct binding pockets, one for glucose and one for the product G6P / ATP. In many cancers, an unusual over-expression of this enzyme appears to help immortalise malignant cells, allowing a constant flow of newly synthesised ATP used for glucose phosphorylation. Consequently, the G6P produced is further transformed into carbon available to synthesise new cell membranes and lactic acid, inducing acidification of the intracellular environment. The voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1) is a β-barrel protein of about 30 kDa expressed in monomeric form in the outer mitochondrial membrane of all eukaryotes. It constitutes the main port for the transport of metabolites, including ATP. VDAC1 regulates cell metabolism and represents a convergence point for different cell survival and programmed death signals, mediated by its interaction with other ligands and proteins. Furthermore, VDAC1 is involved in the molecular processes of some neurodegenerative diseases and various types of cancer. In normal cells, an interaction occurs between HK-I and VDAC1 on the cytosolic side of the outer mitochondrial membrane, playing an essential role in regulating cellular glucose metabolism and protecting the cell against apoptosis. At the same time, this interaction implies tumorigenesis: in tumour cells, an unusual overexpression of HK-I and VDAC1 causes them to interact more, inhibiting VDAC1 from binding pro-apoptotic factors to further stimulation of glycolysis, giving metabolic benefits and immortalisation of the cell. The experimental work of this thesis aims to identify cloning, expression, and purification protocols specific for the human VDAC1 and HK-I, to isolate, in vitro, the VDAC1-HK complex for further structural and ligand interaction studies.

Clonaggio, espressione e purificazione dell'Esochinasi 1 umana e del Canale Anionico Voltaggio Dipendente 1 umano. Un approccio analitico per la loro interazione e isolamento del complesso proteina-proteina. L'esochinasi è il primo enzima della via aerobica del catabolismo del glucosio, la glicolisi, in cui catalizza la fosforilazione del glucosio, attraverso l'idrolisi dell'ATP, in glucosio-6-fosfato (G6P). L'isoforma HK-I è una proteina citosolica di 108 kDa, formata da un'unica catena polipeptidica composta da 917 aminoacidi, divisa in due domini, l'N-terminale (residui 1–474) e il C-terminale (475–917). La funzione regolatrice di HK-I è caratteristica del dominio N-terminale, mentre quella catalitica è svolta dal dominio C-terminale, che ha due distinte tasche di legame, una per il glucosio e una per il prodotto G6P e ATP. In molti tumori, un'insolita sovraespressione di questo enzima sembra aiutare a immortalare le cellule maligne, consentendo un flusso costante di ATP di nuova sintesi utilizzato per la fosforilazione del glucosio. Di conseguenza, il G6P prodotto viene ulteriormente trasformato in carbonio disponibile per la sintesi di nuove membrane cellulari e di acido lattico, inducendo un'acidificazione dell'ambiente intracellulare. Il canale anionico voltaggio-dipendente 1 (VDAC1) è una proteina β-barile di circa 30 kDa espressa in forma monomerica nella membrana mitocondriale esterna di tutti gli eucarioti, di cui costituisce il poro principale per il trasporto dei metaboliti, compreso l'ATP. VDAC1 regola il metabolismo cellulare e rappresenta un punto di convergenza per diversi segnali di sopravvivenza cellulare e morte programmata mediati dalla sua interazione con altri ligandi e proteine. Inoltre, il VDAC1 è coinvolto nei processi molecolari di alcune malattie neurodegenerative e in vari tipi di cancro. Nelle cellule normali, si verifica un'interazione tra HK-I e VDAC1, sul lato citosolico della membrana mitocondriale esterna, svolgendo un ruolo importante nella regolazione del metabolismo cellulare del glucosio e nella protezione della cellula dall'apoptosi. Allo stesso tempo, questa interazione ha un'implicazione nella tumorigenesi: nelle cellule tumorali, un'insolita sovraespressione di HK-I e VDAC1 fa sì che interagiscano maggiormente, inibendo VDAC1 dal legame di fattori pro-apoptotici e portando a un'ulteriore stimolazione della glicolisi, dando benefici metabolici e l'immortalizzazione della cellula. Il lavoro sperimentale di questa tesi mira all'identificazione di protocolli di clonaggio, espressione e purificazione specifici per VDAC1 e HK-I umani, per isolare, in vitro, il complesso VDAC1-HK per studi strutturali e di interazione con ligandi.