The work that will be presented in the following thesis is aimed at determining the crystallographic structure of the GLT25D1 protein. This protein is an enzyme involved in the post-translational modifications of collagen, and in particular in the galactosylation of hydroxylated lysine residues. Mutations in this enzyme are responsible for a broad spectrum of syndromes and pathologies, from connective tissue disorders, neurodegenerative diseases and in the metastatic progression of solid tumors. In particular, the thesis will first analyze the molecular and biochemical technologies for the production of the GLT25D1 protein: expression of recombinant proteins in bacterial cells, purification through chromatographic techniques and biochemical analysis through SDS-PAGE gel electrophoresis. The second part will concern the theoretical bases and the techniques necessary for the determination of the crystallographic structure of GLT25D1. Then the main crystallization techniques will be introduced, such as hanging drop and sitting drop, and the experimental steps for the resolution of the crystallographic structure of GLT25D1. Particular emphasis will be placed on the Single-wavelength Anomalous dispersion (SAD) methodology, used to solve the phase problem of the protein under study. The future perspectives of the work is a more detailed understanding of the function of the enzyme, based on the structure, GLT25D1 in the complex scenario of post-translational modifications of collagen. This is a potential starting point for the development of potential inhibitors for the treatment of syndromes and diseases caused by mutations in GLT25D1.
Determinazione della struttura cristallografica di GLT25D1. Il lavoro che verrà presentato nella seguente tesi è mirato nella determinazione della struttura cristallografica della proteina GLT25D1. Questa proteina è un'enzima implicato nelle modificazioni post-traduzionali del collagene, ed in particolare nella galattosilazione dei residui di lisina idrossilati. Mutazioni a carico di questo enzima sono responsabili di un ampio spettro di sindromi e patologie, da disordini del tessuto connettivo, malattie neurodegenerative e nella progressione metastatica dei tumori solidi. In particolare la tesi tratterà in prima analisi delle tecnologie molecolari e biochimiche per la produzione della proteina GLT25D1: espressione di proteine ricombinanti in cellule batteriche, purificazione attraverso tecniche cromatografiche e analisi biochimica attraverso elettroforesi su gel SDS-PAGE. La seconda parte riguarderà invece le basi teoriche e le tecniche necessarie per la determinazione della struttura cristallografica di GLT25D1. Quindi verranno introdotte le principali tecniche di cristallizzazione, quali hanging drop e sitting drop, e le fasi sperimentali per la risoluzione della struttura cristallografica di GLT25D1. Verrà posta particolare enfasi sulla metodologia SAD (Single-wavelength Anomalous dispersion) , utilizzata per risolvere il problema delle fasi della proteina oggetto di studio. Le prospettive future del lavoro è una comprensione più dettagliata della funzione dell'enzima, sulla base della struttura,GLT25D1 nel complesso scenario delle modificazioni post-traduzionale del collagene. Questo è un potenziale punto di partenza per lo sviluppo di potenziali inibitori per il trattamento di sindromi e patologie causate da mutazioni a carico di GLT25D1
Determination of the crystal structure of GLT25D1
DE MARCO, MATTEO
2020/2021
Abstract
The work that will be presented in the following thesis is aimed at determining the crystallographic structure of the GLT25D1 protein. This protein is an enzyme involved in the post-translational modifications of collagen, and in particular in the galactosylation of hydroxylated lysine residues. Mutations in this enzyme are responsible for a broad spectrum of syndromes and pathologies, from connective tissue disorders, neurodegenerative diseases and in the metastatic progression of solid tumors. In particular, the thesis will first analyze the molecular and biochemical technologies for the production of the GLT25D1 protein: expression of recombinant proteins in bacterial cells, purification through chromatographic techniques and biochemical analysis through SDS-PAGE gel electrophoresis. The second part will concern the theoretical bases and the techniques necessary for the determination of the crystallographic structure of GLT25D1. Then the main crystallization techniques will be introduced, such as hanging drop and sitting drop, and the experimental steps for the resolution of the crystallographic structure of GLT25D1. Particular emphasis will be placed on the Single-wavelength Anomalous dispersion (SAD) methodology, used to solve the phase problem of the protein under study. The future perspectives of the work is a more detailed understanding of the function of the enzyme, based on the structure, GLT25D1 in the complex scenario of post-translational modifications of collagen. This is a potential starting point for the development of potential inhibitors for the treatment of syndromes and diseases caused by mutations in GLT25D1.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
Per maggiori informazioni e per verifiche sull'eventuale disponibilità del file scrivere a: unitesi@unipv.it.
https://hdl.handle.net/20.500.14239/13937