Caratterizzazione del profilo farmacodinamico di nuovi ligandi del recettore Sigma-1 nel modello cellulare di differenziamento neuronale PC12.

Il recettore Sigma -1 è una piccola proteina transmembrana, dal peso di 25 Kda, localizzata nel re-ticolo endoplasmatico (RE) a livello delle membrane associate ai mitocondri (MAM). S1R può essere considerato come una chaperonina, in grado di modificare facilmente la propria conforma-zione tridimensionale e andare ad interagire con altri partners proteici e recettori a livello del RE e della membrana plasmatica, modulandone l’attività. S1R è molto espresso sia nel sistema nervo-so centrale che in quello periferico. S1R svolge un ruolo importante nella regolazione delle fun-zioni mitocondriali ed è coinvolto anche nella risposta allo stress del reticolo endoplasmatico e nell’apoptosi. Alterazioni di S1R sono state riscontrate in diverse patologie umane come il cancro, patologie neurodegenerative e disordini di natura psichiatrica e dipendenza da droghe di abuso come la cocaina. In particolare S1R è coinvolto nei disturbi di apprendimento e di memoria, disturbi cognitivi e malattie neurodegenerative come ad esempio Alzheimer, Parkinson, Sclerosi laterale amiotrofica, Sclerosi multipla, e la malattia di Huntington. Numerosi studi hanno dimostrato il coinvolgimento di S1R nei meccanismi di neuroprotezione, stress ossidativo e neuroinfiammazione. Per questo motivo, sempre maggiori sforzi si sono foca-lizzati sullo sviluppo di ligandi selettivi di S1R, in grado di modularne l’attività, con conseguenti importanti potenziali implicazioni terapeutiche. Lo scopo di questa tesi è stato quello di validare il profilo farmacologico di nuovi ligandi di S1R (BS148, PL16 e PL22) servendosi di un saggio cellulare consolidato, consistente nel differenzia-mento neuritico della linea cellulare PC12. Questi ligandi sono caratterizzati da un’ottima affinità per il recettore e da un interessante effetto neuroprotettivo in diversi paradigmi di neurotossicità in colture cellulari neuronali. In particolare, dal momento che BS148 presenta un centro chirale, in un lavoro precedente erano stati isolati i suoi enantiomeri e in questa tesi si è voluto analizzare il loro profilo farmacodinamico su S1R. I ligandi PL16 e PL22 derivano dalla linearizzazione della struttura chimica dei composti della serie del BS148, per eliminare il centro chirale. Di questi composti è nota l’alta affinità per S1R ma non era ancora stato possibile verificarne il profilo farmacodinamico, che è stato analizzato in questa tesi. Gli esperimenti condotti hanno permesso di dimostrare il profilo agonista S1R per tutti i ligandi testati, mettendo in luce anche un potenzia-le effetto antiproliferativo, che sarà interessante approfondire in ulteriori futuri studi. Per eseguire questo studio abbiamo calcolato che si è reso necessario eseguire 11 esperimenti in-dipendenti, valutando un totale di 421.176 cellule in 3072 immagini, contando manualmente (da parte di un operatore adiuvato da altri due ricercatori) un range di cellule che va da un minimo di 24 a un massimo di 172 cellule per immagine. Questo comporta un grosso dispendio temporale e di energie che rallenta l’efficienza del saggio. Pertanto abbiamo apportato delle modifiche, consi-stenti nell’utilizzo di cellule fluorescenti e di un software di analisi di immagine basato sul “ma-chine learning” finalizzate a velocizzare il processo di conta cellulare. I risultati preliminari otte-nuti evidenziano che, nonostante siano necessari ulteriori miglioramenti, le migliorie apportate abbiano consentito di migliorare sensibilmente l’efficienza dell’analisi, gettando le basi per un aumento della performance del saggio. Ulteriori test sono in corso per poter sfruttare tutto il potenziale del nuovo saggio.