Investigating the post-translational mechanisms in the control of RepoMan - 14-3-3 interactions

RepoMan, or CDCA2 (cell cycle-associated protein 2) is a nuclear protein and a specific regulatory subunit of PP1γ, with which it forms a holoenzyme that works as a Serine/Threonine phosphatase. This thesis investigates the molecular mechanisms underlying the interaction between RepoMan and 14-3-3 proteins, and more specifically, the difference in 14-3-3 interaction between full-length RepoMan and its C terminal fragment (713-1023) observed in a mass spectrometry study by Prévost M. et al. in 2013. With mass spectrometry and IP experiments, they observed an interaction of the C terminus of RepoMan with 14-3-3ζ. The same result was not found with full-length RepoMan. We hypothesized that post translational modifications, more specifically phosphorylation, could influence this interaction. We began our investigation with bioinformatic analyses, which showed an overlap between putative 14-3-3/RepoMan interaction sites and putative PKA phosphorylation sites on RepoMan, especially on the C terminus. We then designed a first Western Blot experiment to verify direct PKA phosphorylation of RepoMan, and then a series of Western Blot and Immunofluorescence experiments to investigate how this phosphorylation event influences 14-3-3 binding. We put the cells in a condition of increased cAMP levels, and therefore PKA phosphorylation, and observed the differences with control, or non-treated samples. We generated multiple “phospho-null” mutants and found that endogenous PKA phosphorylates both the wild type and the mutated fragments, but the lack of phosphorylation on the mutated C terminal residues influences the RepoMan/14-3-3 interaction. This was observed in both the C terminus and full-length RepoMan.

Il ruolo delle modificazioni post-traslazionali nel controllo dell'interazione fra RepoMan e 14-3-3. RepoMan, o CDCA2 (cell cycle-associated protein 2) è una proteina nucleare e subunità regolatrice di PP1γ, con cui forma un oloenzima che agisce da serina-treonina fosfatasi. Questa tesi si propone di indagare i meccanismi molecolari sottostanti l’interazione fra RepoMan e le proteine 14-3-3, e nello specifico, la differenza fra l’interazione con 14-3-3 dell’intera proteina RepoMan e il suo frammento C terminale (713-1023), osservata in uno studio con spettrometria di massa da Prévost M. et al. nel 2013. Con la spettrometria di massa e l’immunoprecipitazione, hanno osservato un’interazione di RepoMan C terminale con le 14-3-3ζ. Lo stesso risultato non è comparso con l’intera proteina (full length). Abbiamo ipotizzato che una modificazione post traslazionale, in particolare la fosforilazione, potesse influenzare l’interazione. Abbiamo iniziato la nostra ricerca con analisi bioinformatiche che hanno mostrato una sovrapposizione tra siti putativi di interazione con 14-3-3 e fosforilazione da PKA su RepoMan. Con esperimenti di western blot abbiamo verificato la fosforilazione diretta da PKA, e poi con esperimenti di western blot e immunofluorescenza abbiamo indagato il ruolo della fosforilazione nell’interazione. Aumentando le concentrazioni di AMP ciclico nelle cellule, e quindi di fosforilazione da PKA, abbiamo osservato le differenze con i campioni non trattati. Abbiamo generato mutazioni di RepoMan “phospho-null”, e scoperto che la PKA endogena fosoforila sia wild type che mutanti, ma la mancanza di fosforilazione sul C terminale phospho-null influenza l’interazione con le 14-3-3. Questo è stato osservato sia nella proteina full-length che nel frammento C terminale.