Calcium is an essential intracellular messenger in mammalian neurons, and it’s suitable as a proxy for measuring their activity, as most neurons have a big rise in intracellular Calcium concentration during neuronal firing. It’s not therefore surprising that an increasing number of neuroscientists are adopting genetically encoded calcium indicators (GECIs) in their laboratories to evaluate neural behavior by monitoring cellular changes in fluorescence. In particular, calcium imaging techniques are very promising, as they can be performed with several microscopy setups, such as epifluorescence, two-photon, or head-mounted microscopes, and give back both a global or a single-cell resolution view of cellular activity. In this thesis, we focus on the in-vitro single-cell resolution Calcium Imaging technique, performed on acute brain slices obtained by GCamp6s expressing mice. Calcium imaging is a powerful method to record the activity of a vast population of neurons, but while the sensors and microscopes have matured over time, computational methods to process the resulting movies are still in development because of several issues including motion artifacts, background contamination arising from the neuropil, unbiased and automated detection of the cells in the field of view, photobleaching correction, fluorescence signal extraction and their analysis. Luckily, in the past years, recent tools like CaImAn or Suite2P have been developed, but there is still a barrier for many laboratories to adopt these packages, as they still require programming skills to be used and usually skip the fluorescence signal analysis. The need to apply one of these tools to calcium imaging videos and process the results is the scenario in which this thesis work started. More precisely, first of all, we introduced the before-mentioned Suite2P tool and developed a Python pipeline to apply it to our imaging data. We then developed a user-friendly MATLAB graphical user interface (GUI) to analyze Suite2P outputs and process fluorescence traces. Firstly, with the MATLAB GUI, we present a method to analyze changes in neuronal activity in response to pharmacological agonists or antagonists, in order to assess the eventual presence of depolarization/hyperpolarization in the slice with a single-cell resolution view. We then provide a method to find oscillating patterns or events in the cellular activity and to estimate the temporal relationship between neurons being part of the same brain slice. The pipeline here developed had been used to analyze several in-vitro calcium imaging recordings acquired in different neural regions and experimental conditions, showing promising results and allowing to register small voltage variations with high sensitivity. All the methods here proposed and developed can be used on low-cost computers, allowing an easy inspection of data and manual correction of automatically suggested results.

Il calcio è un messaggero intracellulare essenziale per i neuroni, ed è perciò adatto ad essere utilizzato come proxy per misurarne l’attività: la maggior parte dei neuroni, infatti, rispetto alla condizione di riposo, vede un grande aumento della concentrazione dello ione calcio durante lo svolgersi di un potenziale d’azione. Non sorprende, quindi, che un numero crescente di neuroscienziati stia adottando i Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) nei propri laboratori per valutare il comportamento neurale attraverso il monitoraggio del livello di fluorescenza emesso dalle cellule. In particolare, le tecniche di calcium imaging sono molto promettenti, perché permettono di avere una visione sia globale che a singola cellula dell’attività neurale, ed in quanto possono essere eseguite con diverse tecniche di microscopia quali a epifluorescenza, a due fotoni, o con microscopi impiantabili sulle ossa craniche. In questa tesi, ci concentreremo sulla versione in-vitro di calcium imaging a singola cellula, eseguita acquisendo l’attività neurale a partire da fette cerebrali ottenute da topi che esprimono l’indicatore di calcio GCamp6s. Il calcium imaging risulta essere un metodo efficace per registrare l'attività di vaste popolazioni neurali. Tuttavia, mentre la strumentazione necessaria alla sua realizzazione è migliorata col tempo, i metodi computazionali per elaborare i filmati acquisiti durante la fase sperimentale sono ancora in fase di sviluppo a causa di diversi problemi intrinseci a questo tipo di tecnica. Tra questi menzioniamo la presenza di artefatti da movimento, la contaminazione di background dovuta al neuropilo, la necessità di rilevare in modo automatico e unbiased le cellule che si trovano nel campo visivo, gli artefatti legati a effetti di photobleaching, ed infine le difficoltà nell’estrarre e analizzare i segnali di fluorescenza provenienti da ogni cellula. Fortunatamente, negli ultimi anni sono stati sviluppati strumenti software come CaImAn o Suite2P, ma c'è ancora una barriera per molti laboratori nel loro utilizzo, in quanto richiedono delle abilità di programmazione e solitamente saltano la fase di processing del segnale di fluorescenza ottenuto, fermandosi alla sua estrazione. La necessità di applicare uno di questi software ed elaborare i risultati ottenuti col calcium imaging è lo scenario in cui si è sviluppato questo lavoro di tesi. Più precisamente, come primo step, abbiamo adottato Suite2P per l’estrazione dei segnali e sviluppato una pipeline Python per applicarlo ai nostri dati di imaging. Abbiamo quindi sviluppato un'interfaccia grafica (GUI) con MATLAB per analizzare i segnali di fluorescenza ottenuti con Suite2P. Con la GUI MATLAB presentiamo, anzitutto, un metodo per analizzare i cambiamenti nell'attività neuronale in risposta ad agonisti o antagonisti farmacologici, in modo da valutare l'eventuale presenza di depolarizzazione/iperpolarizzazione nella fetta con risoluzione unicellulare. In secondo luogo, forniamo un metodo per riconoscere e isolare pattern oscillanti nell'attività cellulare, nonché per stimare la relazione temporale tra gli eventi individuati nei segnali di fluorescenza provenienti da neuroni appartenenti alla stessa fetta cerebrale. La pipeline qui sviluppata è stata utilizzata per analizzare diverse registrazioni di calcium imaging in-vitro, acquisite in diverse regioni neurali e sotto condizioni sperimentali differenti, mostrando risultati promettenti e consentendo di registrare con alta sensibilità piccole variazioni di potenziale di membrana. I metodi qui proposti, infine, possono essere utilizzati su macchine di basso costo, consentono una facile ispezione visiva dei dati e permettono all’operatore di correggere e modificare facilmente i risultati proposti.

Detecting neural activity from in vitro calcium imaging data: development of a signal processing pipeline.

FANARI, OLEKSANDRA
2020/2021

Abstract

Calcium is an essential intracellular messenger in mammalian neurons, and it’s suitable as a proxy for measuring their activity, as most neurons have a big rise in intracellular Calcium concentration during neuronal firing. It’s not therefore surprising that an increasing number of neuroscientists are adopting genetically encoded calcium indicators (GECIs) in their laboratories to evaluate neural behavior by monitoring cellular changes in fluorescence. In particular, calcium imaging techniques are very promising, as they can be performed with several microscopy setups, such as epifluorescence, two-photon, or head-mounted microscopes, and give back both a global or a single-cell resolution view of cellular activity. In this thesis, we focus on the in-vitro single-cell resolution Calcium Imaging technique, performed on acute brain slices obtained by GCamp6s expressing mice. Calcium imaging is a powerful method to record the activity of a vast population of neurons, but while the sensors and microscopes have matured over time, computational methods to process the resulting movies are still in development because of several issues including motion artifacts, background contamination arising from the neuropil, unbiased and automated detection of the cells in the field of view, photobleaching correction, fluorescence signal extraction and their analysis. Luckily, in the past years, recent tools like CaImAn or Suite2P have been developed, but there is still a barrier for many laboratories to adopt these packages, as they still require programming skills to be used and usually skip the fluorescence signal analysis. The need to apply one of these tools to calcium imaging videos and process the results is the scenario in which this thesis work started. More precisely, first of all, we introduced the before-mentioned Suite2P tool and developed a Python pipeline to apply it to our imaging data. We then developed a user-friendly MATLAB graphical user interface (GUI) to analyze Suite2P outputs and process fluorescence traces. Firstly, with the MATLAB GUI, we present a method to analyze changes in neuronal activity in response to pharmacological agonists or antagonists, in order to assess the eventual presence of depolarization/hyperpolarization in the slice with a single-cell resolution view. We then provide a method to find oscillating patterns or events in the cellular activity and to estimate the temporal relationship between neurons being part of the same brain slice. The pipeline here developed had been used to analyze several in-vitro calcium imaging recordings acquired in different neural regions and experimental conditions, showing promising results and allowing to register small voltage variations with high sensitivity. All the methods here proposed and developed can be used on low-cost computers, allowing an easy inspection of data and manual correction of automatically suggested results.
2020
Rilevamento dell’attività neurale da calcium imaging in vitro: sviluppo di una pipeline per l’analisi dei segnali di fluorescenza.
Il calcio è un messaggero intracellulare essenziale per i neuroni, ed è perciò adatto ad essere utilizzato come proxy per misurarne l’attività: la maggior parte dei neuroni, infatti, rispetto alla condizione di riposo, vede un grande aumento della concentrazione dello ione calcio durante lo svolgersi di un potenziale d’azione. Non sorprende, quindi, che un numero crescente di neuroscienziati stia adottando i Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) nei propri laboratori per valutare il comportamento neurale attraverso il monitoraggio del livello di fluorescenza emesso dalle cellule. In particolare, le tecniche di calcium imaging sono molto promettenti, perché permettono di avere una visione sia globale che a singola cellula dell’attività neurale, ed in quanto possono essere eseguite con diverse tecniche di microscopia quali a epifluorescenza, a due fotoni, o con microscopi impiantabili sulle ossa craniche. In questa tesi, ci concentreremo sulla versione in-vitro di calcium imaging a singola cellula, eseguita acquisendo l’attività neurale a partire da fette cerebrali ottenute da topi che esprimono l’indicatore di calcio GCamp6s. Il calcium imaging risulta essere un metodo efficace per registrare l'attività di vaste popolazioni neurali. Tuttavia, mentre la strumentazione necessaria alla sua realizzazione è migliorata col tempo, i metodi computazionali per elaborare i filmati acquisiti durante la fase sperimentale sono ancora in fase di sviluppo a causa di diversi problemi intrinseci a questo tipo di tecnica. Tra questi menzioniamo la presenza di artefatti da movimento, la contaminazione di background dovuta al neuropilo, la necessità di rilevare in modo automatico e unbiased le cellule che si trovano nel campo visivo, gli artefatti legati a effetti di photobleaching, ed infine le difficoltà nell’estrarre e analizzare i segnali di fluorescenza provenienti da ogni cellula. Fortunatamente, negli ultimi anni sono stati sviluppati strumenti software come CaImAn o Suite2P, ma c'è ancora una barriera per molti laboratori nel loro utilizzo, in quanto richiedono delle abilità di programmazione e solitamente saltano la fase di processing del segnale di fluorescenza ottenuto, fermandosi alla sua estrazione. La necessità di applicare uno di questi software ed elaborare i risultati ottenuti col calcium imaging è lo scenario in cui si è sviluppato questo lavoro di tesi. Più precisamente, come primo step, abbiamo adottato Suite2P per l’estrazione dei segnali e sviluppato una pipeline Python per applicarlo ai nostri dati di imaging. Abbiamo quindi sviluppato un'interfaccia grafica (GUI) con MATLAB per analizzare i segnali di fluorescenza ottenuti con Suite2P. Con la GUI MATLAB presentiamo, anzitutto, un metodo per analizzare i cambiamenti nell'attività neuronale in risposta ad agonisti o antagonisti farmacologici, in modo da valutare l'eventuale presenza di depolarizzazione/iperpolarizzazione nella fetta con risoluzione unicellulare. In secondo luogo, forniamo un metodo per riconoscere e isolare pattern oscillanti nell'attività cellulare, nonché per stimare la relazione temporale tra gli eventi individuati nei segnali di fluorescenza provenienti da neuroni appartenenti alla stessa fetta cerebrale. La pipeline qui sviluppata è stata utilizzata per analizzare diverse registrazioni di calcium imaging in-vitro, acquisite in diverse regioni neurali e sotto condizioni sperimentali differenti, mostrando risultati promettenti e consentendo di registrare con alta sensibilità piccole variazioni di potenziale di membrana. I metodi qui proposti, infine, possono essere utilizzati su macchine di basso costo, consentono una facile ispezione visiva dei dati e permettono all’operatore di correggere e modificare facilmente i risultati proposti.
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14239/14301