Utilizzo selettivo di enzimi in processi per la preparazione di molecole di interesse nel settore delle fragranze

The growing awareness of environmental issues drives the search for new production technologies or the improvement of current ones. New technologies based on the concepts of green chemistry are part of this context. The design of products and processes that reduce or eliminate the use and generation of dangerous substances is a comprehensive approach applicable to all aspects of chemistry. Green chemistry concepts apply to an incredible series of scientific activities, including enzymatic biocatalysis. The design and application of new catalysts and catalytic systems are achieving the twin goals of environmental protection and economic benefit. This thesis project, carried out within the Scent Of Lombardy project, is aimed at the development of molecules for fragrances through biocatalytic processes with low environmental impact solvents. The thesis activity, carried out in the laboratories of Bict S.R.L., was divided into two project lines: in the first project, in collaboration with the Department of Organic Chemistry of the University of Pavia, enzymes of the Lipase family were studied for the synthesis of lactones, molecules present as ingredients in fragrances. The immobilized enzyme Lipase from Candida antarctica was studied, tested on various types of substrates for immobilization and its activity was also tested on two different substrates, such as the intermediate of the ambrettolide synthesis pathway and 16-hydroxyhexadecanoic acid to obtain 16-hexadecanolide. The comparison between the various types of Lipase allowed an evaluation of the yield in terms of percentage of formation of the final product. The second project instead involved a study on the enzymatic activity of Squalene Hopene Cyclase, a cyclase capable of cyclizing the linear squalene molecule into the cyclic hopene molecule. All the final molecules belong to a large group of molecules used in the perfume and cosmetic industries. In addition, a colorimetric assay was developed for the identification of the squalene substrate in solution, the substrate under study to verify the catalytic activity of Squalene Hopene Cyclase. Promising results were obtained. It was possible to successfully identify the enzyme Lipase B from Candida antarctica immobilized on Immobead, having a good yield in the selective lactonization reaction of ambrettolide synthesis, unlike other types of enzymatic immobilizations and lipases that showed low yield or undetectable activity towards the substrates of interest. With reference to the enzyme Squalene Hopene Cyclase, however, it was not possible to obtain significant results, the lack of standardized preliminary protocols and the difficulty in obtaining a significant enzymatic purity, affected the final result. An encouraging result has been obtained in the development of a colorimetric assay for the identification of squalene in solution, this result can be the basis for the development of a fast and cheap assay for the detection of this molecule in solution. In conclusion, the results obtained seem to support the hypothesis of the catalytic activity of Lipase B from Candida antarctica on the intermediate substrate of the ambrettolide synthesis pathway. Moreover, a higher catalytic activity of the enzyme immobilized on Immobead allows us to support the hypothesis of the influence of the type of substrate used for immobilization on the enzymatic activity. The results obtained lay the foundations for a possible future development of the industrial process of production of the molecule in accordance with the principles of sustainable chemistry.

La crescente consapevolezza sulle tematiche ambientali spinge la ricerca di nuove tecnologie di produzione o al miglioramento delle attuali. In questo contesto si inseriscono nuove tecnologie basate sui concetti della chimica verde. La progettazione di prodotti e processi che riducono o eliminano l'uso e la generazione di sostanze pericolose, è un approccio globale applicabile a tutti gli aspetti della chimica. I concetti della chimica verde si applicano ad un'incredibile molteplicità di attività scientifiche, tra cui la biocatalisi enzimatica. La progettazione e l'applicazione di nuovi catalizzatori e sistemi catalitici stanno raggiungendo il duplice obiettivo prefissato di protezione ambientale e beneficio economico. Questo progetto di tesi, realizzato nell’ambito del progetto Scent Of Lombardy, è finalizzato allo sviluppo di molecole per le fragranze tramite processi biocatalitici con solventi a basso impatto ambientale. L’attività di tesi, svolta all’interno dei laboratori dell’azienda Bict S.R.L., è stata divisa in due linee progettuali: nel primo progetto, in collaborazione con il Dipartimento di Chimica Organica dell’Università di Pavia, sono stati oggetto di studio enzimi della famiglia delle Lipasi per la sintesi di lattoni, presenti come ingredienti nelle fragranze. Sono stati oggetto di studio l’enzima immobilizzato Lipasi da Candida antarctica, testato su varie tipologie di supporto per l’immobilizzazione ed è stata inoltre testata l’attività su due differenti substrati, quali l’intermedio della via di sintesi dell’ambrettolide e l’acido 16-idrossiesadecanoico. Il confronto fra le varie tipologie di Lipasi ha permesso una valutazione della resa in termini di percentuale di formazione del prodotto finale. Il secondo progetto invece ha previsto uno studio sull’attività enzimatica della Squalene Hopene Ciclase, una Ciclasi in grado di ciclizzare la molecola lineare squalene nella molecola ciclica hopene. Tutte le molecole finali appartengono a un ampio gruppo di molecole utilizzate nell’industria profumiera e cosmetica. Inoltre, è stato sviluppato un saggio colorimetrico per l’identificazione del substrato squalene in soluzione, substrato oggetto di studio per verificare l’attività catalitica della Squalene Hopene Ciclase. Sono stati ottenuti dei risultati promettenti. È stato possibile identificare con successo l’enzima Lipase B da Candida antarctica immobilizzato su Immobead, avente una buona resa nella reazione di lattonizzazione selettiva di sintesi dell’ambrettolide, a differenza di altre tipologie di immobilizzazioni enzimatiche e lipasi che mostravano una resa bassa o attività non rilevabile nei confronti dei substrati di interesse. In riferimento all’enzima Squalene Hopene Ciclase, invece, non è stato possibile poter ottenere risultati significativi, la mancanza di protocolli preliminari standardizzati e la difficoltà nell’ottenere una significativa purezza enzimatica, ha influito sul risultato finale. Infine, è stato ottenuto un risultato incoraggiante nello sviluppo di un saggio colorimetrico per l’identificazione dello squalene in soluzione, tale risultato che dà buoni indizi per il futuro potrà essere la base per lo sviluppo in seguito di un saggio veloce ed economico per la rilevazione di tale molecola in soluzione. In conclusione, i risultati ottenuti sembrano sostenere l’ipotesi dell’attività catalitica della Lipase B da Candida antarctica sul substrato intermedio della via di sintesi dell’ambrettolide. Inoltre, una maggiore attività catalitica dell’enzima immobilizzato su Immobead ci permette di avvalorare l’ipotesi dell’influenza della tipologia di supporto utilizzato per l’immobilizzazione sull’attività enzimatica. I risultati ottenuti pongono le basi per un possibile futuro sviluppo del processo industriale di produzione della molecola in accordo con i principi della chimica sostenibile.