Caratterizzazione di una linea cellulare e un modello murino per lo studio della risposta dinamica di NF-κB mediante imaging di cellule vive

NF- κB dynamics is fundamental for proper transcriptional response to inflammatory stimuli. However, it is also very heterogeneous at single cell level and few is known about the origin of this diverse activation dynamics. Furthermore, we know very few about how the NF- κB system exerts its role in different primary cells. For this reason, in this work we propose an analysis of two different experimental system. The first system is the cell line HeLa MCP-GFP mScarlet-p65, for which we have analyzed the response to different inflammatory stimuli such as TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17. Furthermore, considering the heterogeneity of the cell line, we have analyzed the dynamics at single-cell level in clonal populations, that have allowed us to find different times, intensities and duration of activation. The second system was a new knock-in mouse model. The analysis involves the characterization of the response of NF-kB in cells derived from the model upon inflammatory stimuli: hepatocytes, macrophages and osteoclasts derived from differentiation of the bone marrow cells. In some cells the response was the one expected, but in others not. In parallel, we have performed a genotype characterization of the model to confirm the correct insertion of mScarlet in the desired locus of the RelA gene. However, we found that for some mice the tag is not inserted properly, and this might explain some unexpected results obtained from imaging.

La dinamica di attivazione del fattore nucleare NF- κB è essenziale per determinare la risposta trascrizionale ai segnali infiammatori. Tuttavia, risulta essere estremamente eterogenea a livello della singola cellula e la fonte della dinamica è un campo non del tutto compreso. Inoltre, sappiamo ben poco su come il sistema NF-κB svolga il suo ruolo nelle diverse cellule primarie. Perciò, in questa tesi proponiamo un’analisi della risposta dinamica di NF- κB in risposta a vari stimoli infiammatori in due sistemi diversi. Il primo sistema sono cellule HeLa MCP-GFP mScarlet-p65, per le quali abbiamo caratterizzato la risposta a vari stimoli infiammatori quali, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17. Inoltre, data la sua eterogeneità, la stessa dinamica è stata analizzata a livello della singola cellula, in popolazioni clonali che hanno permesso di evidenziare tempi, intensità e durata di attivazione diverse. Il secondo sistema era un nuovo modello murino. L’analisi prevede invece la caratterizzazione della risposta di NF-κB a stimoli infiammatori in cellule derivate dal modello: epatociti, macrofagi e osteoclasti derivati dal differenziamento delle cellule del midollo osseo. In alcune di queste la risposta è stata osservata ma in altre no. In concomitanza con questi esperimenti è stata necessaria anche la caratterizzazione genica del modello murino per confermare il corretto inserimento della sequenza di mScarlet nel locus desiderato del gene RelA, riscontrando che in alcuni topi l’inserimento è difettoso e questo può spiegare alcuni risultati del nostro imaging.