The project is based on the evaluation of liposomes prepared with different methods and compositions to be used as vectors for the release of proteins in non-physiological conditions, mimicking the hypothermic perfusion of explanted kidney. Two different encapsulation methods, direct and indirect, were tested to enhance the encapsulation efficiency of the protein and optimize its release rate. Bovine serum albumin (BSA) was used as a model protein for the future delivery of a growth factor of the same molecular weight. The liposomes were produced through two preparation techniques: thin film hydration method followed by extrusion and microfluidic technique (Nanoassemblr). The liposomes were formulated with the following lipid compositions: i) cholesterol: DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), ii) cholesterol (Chol): 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP): DSPC, iii) Chol: Phosphatidylethanolamine (PE): DSPC, by varying the lipid ratios. Different methods of BSA encapsulation (10 mg/mL) were evaluated: direct (contextual to the formation of liposomes) and indirect (on already formed liposomes, either by sonication process at 36kHz varying the treatment time or freeze-thawing). The morphological characterization of the liposomes was performed through: Dynamic light scattering (DLS), Nanoparticles tracking analysis (NTA) and Transmission electron microscopy (TEM). Encapsulation efficiency and in vitro release of BSA were determined by spectrophotometric analysis with BCA-kit. In vitro release tests were performed under conditions simulating hypothermic renal perfusion (4°C, PBS, PERF-GEN ™ perfusion liquid). As regards DSPC: Chol composition, the liposomes that have shown greater release rate, high encapsulation efficiency and structural homogeneity, are those obtained through microfluidic technique (Nanoassemblr), and direct encapsulation method, with DSPC:Chol 50:50 molar lipid composition, products with a TFR (total flow rate) of 8 ml/min and with 20% w/w trehalose in the aqueous solution of the protein. The dimensional analysis has always shown average particle size < 200 nm. The liposomes consisting of cationic (DOTAP) and zwitterionic (PE) lipids that have shown the best results are those with molar ratios of lipids DOTAP:DSPC:Chol (5: 47.5: 47.5) and PE:DSPC:Chol (5: 47.5: 47.5) which were found to have average dimensions of 150.5 ± 6.2 nm and with surface charge consistent with their composition: Z = +20 ± 3mV for liposomes with DOTAP, and Z = -37.8 ± 4.5mV (pH:7.8) for liposomes containing lipid zwitterionic. BSA encapsulation efficiency was significantly higher for liposomes made with DOTAP compared to that made with PE liposomes. This result is due to the fact that BSA in solution at pH = 7.4 (higher than the isoelectric point) has a negative charge and therefore EE% is lower due to the repulsion of with negatively charged PE.

Il progetto si basa sulla valutazione di liposomi preparati con metodi e composizioni differenti per essere utilizzati come vettori per il rilascio di proteine in condizioni non fisiologiche, in particolare nella perfusione ipotermica di rene espiantato. Sono stati testati due diversi metodi di incapsulamento, diretto e indiretto, al fine di aumentare l’efficienza di incapsulazione della proteina e ottimizzarne la velocità di rilascio. L’albumina sierica bovina (BSA) è stata utilizzata come proteina modello per la futura veicolazione di un fattore di crescita di pari peso molecolare. I liposomi sono stati prodotti attraverso due tecniche di preparazione: la thin film hydration method seguita da estrusione e la tecnica microfluidica (Nanoassemblr). I liposomi sono stati formulati con le seguenti composizioni lipidiche: i) colesterolo: DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), ii) colesterolo (Chol):1,2-Dioleoil-3-trimetilammonio propano (DOTAP): DSPC, iii) Phosphatidylethanolamine (PE):DSPC:Chol variando i rapporti lipidici. Sono stati valutati diversi metodi di incapsulazione di BSA (10 mg/mL): diretto (contestuale alla formazione dei liposomi) e indiretti (su liposomi già formati, con processi di sonicazione a 36kHz variando il tempo di trattamento e freeze-thawing). La caratterizzazione morfologica dei liposomi è stata eseguita tramite: Dynamic light scattering (DLS), Nanoparticles tracking analysis (NTA) e Trasmission electron microscopy (TEM). È stata determinata l’efficienza di incapsulazione e di rilascio in vitro della BSA tramite analisi spettrofotometrica con BCA-kit. I test di rilascio in vitro sono stati eseguiti in condizioni simulanti la perfusione renale ipotermica (4°C, PBS, liquido di perfusione PERF-GEN™). Per quanto riguarda la composizione DSPC:Chol, i liposomi che hanno mostrato maggior velocità di rilascio, elevata efficienza di incapsulazione e omogeneità strutturale, sono quelli ottenuti attraverso la tecnica microfluidica (Nanoassemblr), e il metodo di incapsulazione diretto, con composizione lipidica molare DSPC:Chol 50:50, prodotti con una TFR (total flow rate) di 8 ml/min e con il 20% di trealosio nella soluzione acquosa della proteina. L’analisi dimensionale ha evidenziato sempre dimensioni particellari medie < 200 nm. I liposomi costituiti da lipidi cationici (DOTAP) e zwitterionici (PE) che hanno mostrato i migliori risultati sono quelli con rapporti molari di lipidi DOTAP:DSPC:Chol (5:47.5:47.5) e PE:DSPC:Chol (5:47.5:47.5) che sono risultati avere dimensioni medie di 150.5 ± 6.2 nm e con carica superficiale coerente con la loro composizione: Z= +20 ± 3mV per i liposomi con DOTAP, e Z= -37.8 ± 4.5mV (in pH 7.8) per liposomi contenenti lipide zwitterionico. L’efficienza di incapsulazione di BSA è stata significativamente superiore per i liposomi con DOTAP rispetto a quella di liposomi contenti PE. Questo risultato è giustificabile dal fatto che la BSA in soluzione a pH=7.4 (superiore a punto isoelettrico) ha carica negativa e quindi per repulsione di cariche l’EE% è minore.

INFLUENZA DELLA COMPOSIZIONE DEI LIPOSOMI NELL’INCAPSULAZIONE E NEL RILASCIO DI PROTEINE.

LANDONE, SELENE
2020/2021

Abstract

The project is based on the evaluation of liposomes prepared with different methods and compositions to be used as vectors for the release of proteins in non-physiological conditions, mimicking the hypothermic perfusion of explanted kidney. Two different encapsulation methods, direct and indirect, were tested to enhance the encapsulation efficiency of the protein and optimize its release rate. Bovine serum albumin (BSA) was used as a model protein for the future delivery of a growth factor of the same molecular weight. The liposomes were produced through two preparation techniques: thin film hydration method followed by extrusion and microfluidic technique (Nanoassemblr). The liposomes were formulated with the following lipid compositions: i) cholesterol: DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), ii) cholesterol (Chol): 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP): DSPC, iii) Chol: Phosphatidylethanolamine (PE): DSPC, by varying the lipid ratios. Different methods of BSA encapsulation (10 mg/mL) were evaluated: direct (contextual to the formation of liposomes) and indirect (on already formed liposomes, either by sonication process at 36kHz varying the treatment time or freeze-thawing). The morphological characterization of the liposomes was performed through: Dynamic light scattering (DLS), Nanoparticles tracking analysis (NTA) and Transmission electron microscopy (TEM). Encapsulation efficiency and in vitro release of BSA were determined by spectrophotometric analysis with BCA-kit. In vitro release tests were performed under conditions simulating hypothermic renal perfusion (4°C, PBS, PERF-GEN ™ perfusion liquid). As regards DSPC: Chol composition, the liposomes that have shown greater release rate, high encapsulation efficiency and structural homogeneity, are those obtained through microfluidic technique (Nanoassemblr), and direct encapsulation method, with DSPC:Chol 50:50 molar lipid composition, products with a TFR (total flow rate) of 8 ml/min and with 20% w/w trehalose in the aqueous solution of the protein. The dimensional analysis has always shown average particle size < 200 nm. The liposomes consisting of cationic (DOTAP) and zwitterionic (PE) lipids that have shown the best results are those with molar ratios of lipids DOTAP:DSPC:Chol (5: 47.5: 47.5) and PE:DSPC:Chol (5: 47.5: 47.5) which were found to have average dimensions of 150.5 ± 6.2 nm and with surface charge consistent with their composition: Z = +20 ± 3mV for liposomes with DOTAP, and Z = -37.8 ± 4.5mV (pH:7.8) for liposomes containing lipid zwitterionic. BSA encapsulation efficiency was significantly higher for liposomes made with DOTAP compared to that made with PE liposomes. This result is due to the fact that BSA in solution at pH = 7.4 (higher than the isoelectric point) has a negative charge and therefore EE% is lower due to the repulsion of with negatively charged PE.
2020
HOW LIPOSOMES COMPOSITION CAN AFFECT PROTEIN ENCAPSULATION AND RELEASE.
Il progetto si basa sulla valutazione di liposomi preparati con metodi e composizioni differenti per essere utilizzati come vettori per il rilascio di proteine in condizioni non fisiologiche, in particolare nella perfusione ipotermica di rene espiantato. Sono stati testati due diversi metodi di incapsulamento, diretto e indiretto, al fine di aumentare l’efficienza di incapsulazione della proteina e ottimizzarne la velocità di rilascio. L’albumina sierica bovina (BSA) è stata utilizzata come proteina modello per la futura veicolazione di un fattore di crescita di pari peso molecolare. I liposomi sono stati prodotti attraverso due tecniche di preparazione: la thin film hydration method seguita da estrusione e la tecnica microfluidica (Nanoassemblr). I liposomi sono stati formulati con le seguenti composizioni lipidiche: i) colesterolo: DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), ii) colesterolo (Chol):1,2-Dioleoil-3-trimetilammonio propano (DOTAP): DSPC, iii) Phosphatidylethanolamine (PE):DSPC:Chol variando i rapporti lipidici. Sono stati valutati diversi metodi di incapsulazione di BSA (10 mg/mL): diretto (contestuale alla formazione dei liposomi) e indiretti (su liposomi già formati, con processi di sonicazione a 36kHz variando il tempo di trattamento e freeze-thawing). La caratterizzazione morfologica dei liposomi è stata eseguita tramite: Dynamic light scattering (DLS), Nanoparticles tracking analysis (NTA) e Trasmission electron microscopy (TEM). È stata determinata l’efficienza di incapsulazione e di rilascio in vitro della BSA tramite analisi spettrofotometrica con BCA-kit. I test di rilascio in vitro sono stati eseguiti in condizioni simulanti la perfusione renale ipotermica (4°C, PBS, liquido di perfusione PERF-GEN™). Per quanto riguarda la composizione DSPC:Chol, i liposomi che hanno mostrato maggior velocità di rilascio, elevata efficienza di incapsulazione e omogeneità strutturale, sono quelli ottenuti attraverso la tecnica microfluidica (Nanoassemblr), e il metodo di incapsulazione diretto, con composizione lipidica molare DSPC:Chol 50:50, prodotti con una TFR (total flow rate) di 8 ml/min e con il 20% di trealosio nella soluzione acquosa della proteina. L’analisi dimensionale ha evidenziato sempre dimensioni particellari medie < 200 nm. I liposomi costituiti da lipidi cationici (DOTAP) e zwitterionici (PE) che hanno mostrato i migliori risultati sono quelli con rapporti molari di lipidi DOTAP:DSPC:Chol (5:47.5:47.5) e PE:DSPC:Chol (5:47.5:47.5) che sono risultati avere dimensioni medie di 150.5 ± 6.2 nm e con carica superficiale coerente con la loro composizione: Z= +20 ± 3mV per i liposomi con DOTAP, e Z= -37.8 ± 4.5mV (in pH 7.8) per liposomi contenenti lipide zwitterionico. L’efficienza di incapsulazione di BSA è stata significativamente superiore per i liposomi con DOTAP rispetto a quella di liposomi contenti PE. Questo risultato è giustificabile dal fatto che la BSA in soluzione a pH=7.4 (superiore a punto isoelettrico) ha carica negativa e quindi per repulsione di cariche l’EE% è minore.
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