Caratterizzazione della anidrasi carbonica CanB di Mycobacterium tuberculosis, un promettente bersaglio per nuove molecole farmacologiche.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è l’agente eziologico della tubercolosi (TB), una delle patologie che, prima dell’avvento del COVID-19, contava il maggior numero di vittime da singolo agente infettivo. Si calcola che nel 2020 circa 10 milioni di persone abbiano contratto la malattia e che circa 1,5-2 milioni muoiano ogni anno. La battaglia contro TB è inasprita dal fatto che si riescano ad isolare sempre più ceppi farmaco resistenti, classificati come rifampicina resistenti (RR-TB), mediamente resistenti (MDR-TB) ed estensivamente resistenti (XDR-TB). Il protocollo di cura per la tubercolosi si basa su una serie di molecole farmacologiche classificate, in base al rapporto tra efficienza e tossicità, in farmaci dalla prima alla terza linea. Dopo un’attenta diagnosi, per ciascun paziente viene messo a punto il profilo di terapia migliore, prescrivendo sempre molteplici farmaci contemporaneamente, per una durata che per TB farmaco sensibile è all’incirca di sei mesi, ma per i ceppi resistenti può arrivare oltre i 20 mesi. La difficoltà nell’eliminazione di Mtb dall’organismo risiede nella grande capacità di adattamento del micobatterio, che una volta fagocitato dai macrofagi polmonari, può restarvici per un tempo indeterminato, anche per tutta la durata della vita dell’ospite; questo accade perché Mtb si è evoluto in modo da riuscire a contrastare i meccanismi messi in atto dal sistema immunitario dell’ospite entrando in uno stato di latenza per cui risulta difficile la completa eliminazione. Il lavoro di ricerca svolto in questa tesi parte dall’obbiettivo di ricercare nuove molecole farmacologiche per contrastare TB che siano migliori di quelle già in uso e che possiedano un meccanismo d’azione differente di modo da riuscire a trattare anche i casi di farmaco resistenza. In particolare, le anidrasi carboniche si sono rivelati enzimi essenziali per la sopravvivenza del batterio, poiché coinvolte nel metabolismo e omeostasi del pH e del carbonio e di conseguenza, costituiscono un ottimo target per la sperimentazione di nuove molecole contro TB. Le anidrasi carboniche presenti in Mtb sono zinco-enzimi e fanno parte della classe delle β-CA, non presenti nell’uomo. In particolare, precedentemente al lavoro svolto in questa tesi, tramite docking molecolare sono state individuate molecole che potessero inibire CanB, l’anidrasi carbonica codificata dal gene Rv3588c di Mtb, adottando quindi un approccio target to drug. Tali molecole sono state poi testate su colture knockdown per CanB, confermando sia l’effettiva azione inibitoria sulla crescita del micobatterio, sia il target, poiché la potenza inibitoria procedeva di pari passo col grado di attenuazione. Descritto nella tesi è il procedimento di clonaggio, espressione eterologa e purificazione di CanB per la caratterizzazione dell’enzima e la valutazione dell’attività dei potenziali inibitori in vitro. La caratterizzazione dell’enzima e la quantificazione dell’attività inibitoria dei composti è stata effettuata allo spettrofotometro, saggiando l’attività esterasica di CanB. Si e perciò misurata la produzione di indolo a 375 nm, utilizzando come substrato indossil-acetato. Tramite fluorimetria a scansione differenziale sono stati poi effettuati saggi di Thermal shift, allo scopo di chiarie l’affinità degli inibitori per l’enzima. I risultati ottenuti in questa ricerca confermano la capacità inibitoria dei composti sull’attività esterasica di CanB, e ne rivelano un’alta affinità per l’enzima, ponendo le basi per ulteriori approfondimenti da svolgersi sull’attività idrolasica principale, con la prospettiva di esperimenti su modelli in vivo di infezione murina.