Nanosfere e nanostelle d'oro decorate dal Trastuzumab: ottimizzazione del protocollo di bioconiugazione

Breast cancer is the most common cancer and is the second leading cause of death in women. Breast cancer represents a biologically and phenotypically heterogeneous collection of diseases with different clinical and treatment response behavior. Usually, these pathologies are treated with chemotherapy and radiotherapy, with surgical treatments and with immunotherapy, such as the ones based on the monoclonal antibody Trastuzumab. This drug is able to recognize the HER-2 receptor (epidermal growth factor receptor 2). In recent years, nanotechnologies have aroused strong interest in the biomedical field, in particular gold nanoparticles (AuNPs) which, thanks to their unique chemical, optical and electrical properties, can be exploited for various applications. These applications include image-based therapeutic techniques, such as for cancer detection, photothermal therapy and drug delivery. The main purpose of this thesis was to conjugate gold nanospheres and nanostars with Trastuzumab and optimize the bioconjugation protocol. Nanoparticles, after being produced, were surrounded by a PEG (polyethylene glycol) with maleimide as a terminal group. Maleimide is able to form covalent bonds with the free -SH groups of the antibody present in cysteine residues. These amino acids are used in formation of disulfide bonds that confer the three-dimensional structures of the antibody, which are important for their biological activity. Currently different strategies can be adopted such us the use of linkers or reducing the disulfide bridges already present in the antibody. In this work free -SH groups were obtained by reducing the antibody with the reducing agent TCEP and subsequently conjugating it to the nanoparticles. Since the bioconjugation depends on different parameters, it was performed an optimization with different time of incubation, and NP/antibody ratio. The conjugation was characterized by dynamic light scattering (DLS) and UV-Vis spectrophotometer. To confirm and quantify the presence of the antibody on nanoparticles surface, two techniques were performed: one indirect (BCA assay) and one direct (Dot Blot). The antibody’s conjugation to both types of gold nanospheres and nanostars was successfully confirmed. The specificity of Trastuzumab-nanoparticles complex was evaluated in vitro on two different cell lines: SK-BR-3, a HER-2 positive breast cancer cell line, and MCF-7, breast cancer cells that express less the HER-2 receptor. Both cell-ELISA assay and confocal laser scanning microscopy CLSM imaging confirmed the Trastuzumab-nanoparticles capability to detect overexpressing-HER-2 cells. In conclusion this work has demonstrated that the reduction time and initial Trastuzumab concentration is important in order to increase the conjugation efficiency. Further investigations are required to asses the efficacy of the obtained nanoparticles.

Il cancro al seno è il tumore più comune ed è la seconda causa di morte nelle donne. Il cancro al seno rappresenta un insieme eterogeneo biologicamente e fenotipicamente di malattie con differenti comportamenti di risposta clinica e terapeutica. Solitamente, queste patologie vengono trattate con chemioterapia e radioterapia, con trattamenti chirurgici e con immunoterapia, come quelle a base dell'anticorpo monoclonale Trastuzumab. Questo farmaco è in grado di riconoscere il recettore HER-2 (recettore del fattore di crescita epidermico 2). Negli ultimi anni le nanotecnologie hanno suscitato un forte interesse nel campo biomedico, in particolare le nanoparticelle d'oro (AuNPs) che, grazie alle loro proprietà chimiche, ottiche ed elettriche uniche, possono essere sfruttate per svariate applicazioni. Queste applicazioni includono tecniche terapeutiche basate su immagini, come il rilevamento del cancro, la terapia fototermica e la somministrazione di farmaci. Lo scopo principale di questa tesi era coniugare nanosfere d'oro e nanostelle con Trastuzumab e ottimizzare il protocollo di bioconiugazione. Le nanoparticelle, dopo essere state prodotte, sono state circondate da un PEG (polietilenglicole) con maleimmide come gruppo terminale. La maleimmide è in grado di formare legami covalenti con i gruppi -SH liberi dell'anticorpo presente nei residui di cisteina. Questi amminoacidi vengono utilizzati nella formazione di legami disolfuro che conferiscono le strutture tridimensionali dell'anticorpo, importanti per la loro attività biologica. Attualmente si possono adottare diverse strategie come l'uso di linker o la riduzione dei ponti disolfuro già presenti nell'anticorpo.In questo lavoro sono stati ottenuti gruppi -SH liberi riducendo l'anticorpo con l'agente riducente TCEP e successivamente coniugandolo alle nanoparticelle. Poiché la bioconiugazione dipende da diversi parametri, è stata eseguita un'ottimizzazione con diversi tempi di incubazione e rapporto NP/anticorpo. La coniugazione è stata caratterizzata da diffusione dinamica della luce (DLS) e spettrofotometro UV-Vis. Per confermare e quantificare la presenza dell'anticorpo sulla superficie delle nanoparticelle, sono state eseguite due tecniche: una indiretta (saggio BCA) e una diretta (Dot Blot). La coniugazione dell'anticorpo con entrambi i tipi di nanosfere d'oro e nanostelle è stata confermata con successo. La specificità del complesso Trastuzumab-nanoparticelle è stata valutata in vitro su due diverse linee cellulari: SK-BR-3, una linea cellulare di cancro al seno HER-2 positiva, e MCF-7, cellule di cancro al seno che esprimono meno il recettore HER-2. Sia il test ELISA cellulare che l'imaging CLSM al microscopio confocale a scansione laser hanno confermato la capacità delle nanoparticelle di Trastuzumab di rilevare le cellule HER-2 con sovraespressione. In conclusione, questo lavoro ha dimostrato che il tempo di riduzione e la concentrazione iniziale di Trastuzumab sono importanti per aumentare l'efficienza della coniugazione. Sono necessarie ulteriori indagini per valutare l'efficacia delle nanoparticelle ottenute.