ROS (reactive oxygen species) are very unstable molecules that tend to interact with any type of molecule with which they come into contact such as lipids, proteins, carbohydrates and DNA, altering their structure and function. However, it is important to emphasize that they also play beneficial roles within the body as physiological signaling agents and above all their role in the defense mechanism against aggression by pathogenic microorganisms in phagocytes. The enzymes used for the production of ROS are the family of NADPH oxidase (NOX), or membrane proteins responsible for the transfer of electrons across biological membranes, whose final electron acceptor is molecular oxygen. The activation of the NOX2-p22 complex requires the cytosolic proteins p40, p47, p67 and the GTP-ase Rac. The trimera is the protein encoded by a single construct composed of p47 p67 and Rac1 which makes the characterization of cytosolic proteins faster and effective. My thesis project focuses on the biochemical characterization of the trimera and its role in the purification of NOX2-p22 and in maintaining the stability of the membrane complex and on the development of enzymatic assays for the search for inhibitors of the complex. The trimera also made possible blotting on the grid for the structural study of the complex.
L'attivatore citosolico chimerico a catena singola Trimera come nuovo strumento per l'indagine biochimica e strutturale della NADPH Ossidasi 2 nativa. I ROS (specie reattive dell’ossigeno) sono molecole molto instabili che tendono ad interagire con ogni tipo di molecola con la quale vengono a contatto come lipidi, proteine, carboidrati e DNA, alterandone la struttura e la funzione. Tuttavia, è importante sottolineare come essi svolgano anche ruoli benefici all’interno dell’organismo come agenti di segnalazione fisiologica e soprattutto il loro ruolo nel meccanismo di difesa contro l’aggressione da parte di microrganismi patogeni nei fagociti. Gli enzimi adibiti alla produzione dei ROS sono la famiglia delle NADPH ossidasi (NOX), ovvero proteine di membrana deputate al trasferimento di elettroni attraverso le membrane biologiche, il cui accettore finale di elettroni è l’ossigeno molecolare. L’attivazione del complesso NOX2-p22 necessita delle proteine citosoliche p40, p47, p67 e della GTP-asi Rac. La trimera è la proteina codificata da un singolo costrutto composto da p47 p67 e Rac1 che rende la caratterizzazione delle proteine citosoliche più veloce ed efficace. Il mio progetto di tesi si incentra sulla caratterizzazione biochimica della trimera e nel suo ruolo nella purificazione di NOX2-p22 e del mantenimento della stabilità del complesso di membrana e sullo sviluppo di saggi enzimatici per la ricerca di inibitori del complesso. La trimera ha reso inoltre possibile il blotting su grid per lo studio strutturale del complesso.
The chimeric single-chain cytosolic activator Trimera as a new tool for the biochemical and structural investigation of the native NADPH Oxidase 2
BASILE, LORENZO
2021/2022
Abstract
ROS (reactive oxygen species) are very unstable molecules that tend to interact with any type of molecule with which they come into contact such as lipids, proteins, carbohydrates and DNA, altering their structure and function. However, it is important to emphasize that they also play beneficial roles within the body as physiological signaling agents and above all their role in the defense mechanism against aggression by pathogenic microorganisms in phagocytes. The enzymes used for the production of ROS are the family of NADPH oxidase (NOX), or membrane proteins responsible for the transfer of electrons across biological membranes, whose final electron acceptor is molecular oxygen. The activation of the NOX2-p22 complex requires the cytosolic proteins p40, p47, p67 and the GTP-ase Rac. The trimera is the protein encoded by a single construct composed of p47 p67 and Rac1 which makes the characterization of cytosolic proteins faster and effective. My thesis project focuses on the biochemical characterization of the trimera and its role in the purification of NOX2-p22 and in maintaining the stability of the membrane complex and on the development of enzymatic assays for the search for inhibitors of the complex. The trimera also made possible blotting on the grid for the structural study of the complex.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/14638