Identificazione di un metodo efficiente per l’estrazione assistita dalle microonde di alcaloidi indolici da Amathia verticillata

This thesis is part of a project of drug discovery of new antitumoral drugs from natural matrices. The bryozoan Amathia verticillata (delle Chiaje, 1822) object of the study is a marine colonial invertebrate belonging to the Vesiculariidae family, also referred to as sea mat or moss. A fundamental step in drug discovery from natural matrices is the identification of an appropriate method to maximize the mass transfer of the secondary metabolites from the natural matrix to the solvent, maintaining their physical and chemical characteristics and activity. Precisely, the isolation of chemical compounds from natural sources is time-consuming because of the complexity of the matrices. Therefore, I focused on the identification of an efficient method for microwave assisted extraction of alkaloids from the bryozoan Amathia verticillata. There is a recent growing interest towards the phylum Bryozoa due to the promising metabolites that these invertebrates produce. In particular, the species Amathia verticillata it’s known to contain indole alkaloids able to cause vasorelaxation. Over the years, for the extraction of active compounds from natural matrices were utilized both traditional techniques as maceration and percolation and innovative methods as for example ultrasound or microwave assisted extraction (MASE). The latter is an environmental-friendly and cheap method that implies little solvent and short extraction time maintaining high efficiency and reproducibility. In order to develop a proper MASE method, different articles in the literature regarding traditional and innovative extractions of indole alkaloids, techniques used on Amathia verticillata or other similar species, and finally extractions with microwaves were analyzed. Once the most important variables that could affect the final yield were identified, a DoE experimental plan composed by nine experiments was formulated and applied, leading to the definition of the best extraction conditions. The presence of alkaloids in the final extracts was confirmed thanks to the Dragendorff’s reagent and then by the use of an analytical thin layer chromatography, but further studies are needed to establish their chemical structure and their effective amount.

Questo lavoro di tesi si colloca all’interno di un progetto più ampio di drug discovery da fonti naturali finalizzato alla ricerca di nuovi antitumorali di origine naturale. Oggetto della tesi è stata la specie Amathia verticillata (delle Chiaje, 1822), un invertebrato coloniale distribuito in ambienti marini appartenente alla famiglia delle Vesiculariidae, definita stuoia o muschio marino. Uno step fondamentale nel drug discovery da fonti naturali è la messa a punto di un metodo estrattivo che permetta di massimizzare il trasferimento di massa dei metaboliti secondari dalla matrice al solvente, preservandone le caratteristiche chimico-fisiche e l’attività. In particolare, l’isolamento di composti a partire da fonti naturali è molto dispendioso in termini di tempo trattandosi di matrici estremamente complesse. Mi sono per questo concentra sull’identificazione di un metodo per l’estrazione assistita dalle microonde di alcaloidi da Amathia verticillata. Di recente l’interesse del mondo scientifico verso il phylum Bryozoa è cresciuto, si è scoperto infatti che questi invertebrati producono diversi metaboliti responsabili di rilevanti attività chimiche e biologiche. Specificatamente, il genere Amathia contiene alcaloidi indolici di cui è stato dimostrato l’effetto vasodilatatorio. Per l’estrazione di composti attivi da matrici naturali, nel corso degli anni sono state utilizzate sia tecniche tradizionali come macerazione e percolazione, sia metodi innovativi, tra cui l’estrazione assistita da ultrasuoni o microonde (MASE). Quest’ultima è considerata un metodo ecologico ed economico poiché permette di impiegare poco solvente e accorciare i tempi di estrazione pur mantenendo efficienza e riproducibilità. Nella messa a punto di un metodo MASE efficace per gli alcaloidi prodotti dal briozoo, sono stati esaminati diversi articoli scientifici riguardanti sia l’estrazione tramite tecniche convenzionali, sia quelle relativi a generiche estrazioni di alcaloidi indolici. Una volta identificate le principali variabili che possono influenzare la resa finale, è stato formulato e applicato un piano DoE composto da nove esperimenti che consentono di definire le condizioni ideali di estrazione. La presenza degli alcaloidi nei grezzi finali è stata confermata utilizzando il reagente di Dragendorff e in seguito analizzando gli estratti mediante una cromatografia su strato sottile; saranno però necessari ulteriori studi per comprendere quali alcaloidi siano stati estratti e in che quantità.