Effect of degQ deletion on stationary phase phenotypes in B. subtilis

Bacillus subtilis is an aerobic non-pathogenic bacterium, chosen as the model organism of Gram-positive bacteria and commonly described as a “soil bacterium”. Soil is a challenging environment that is usually characterized by sudden lack of nutrients. To survive in this environment, B. subtilis is able to enter into a state known as stationary phase during which growth ceases but cells remain metabolically active. Stationary phase phenotypes of B. subtilis include poly-γ-glutamic acid (γ-PGA) synthesis to ensure bacteria a hydration shell around them, motility to search for nutrients in the environment and competence that allow bacteria to uptake exogenous DNA. Stationary phase behaviors are controlled by several pleiotropic regulators. One of them is DegU which, in its phosphorylated form, is able to bind the promoter of several target genes. DegU is part of DegSU two-component system (TCS) and is activated upon phosphorylation by DegS kinase. Indeed, DegS auto-phosphorylates and then transfers the same phosphate to DegU. A group of mutations in both degS and degU genes are characterized by the hyperproduction of degradative enzymes (Hy phenotype) and therefore denominated degS200Hy and degU32Hy respectively. degS200Hy and degU32Hy mutations have long been considered as equally effective in producing a constitutively active DegU protein. Another type of Hy mutation is the degQ36Hy allele, present only in wild strains and characterized by a 10-fold increase in degQ transcription. DegQ is a short polypeptide of 46 amino acids that is able to stimulate the phosphate transfer from DegS~P to DegU. The aim of this work is to characterize the role of DegQ in the regulation of several stationary phase phenotypes controlled by the TCS DegSU. To investigate the role of DegQ, either degQ gene or the entire degQ locus, including the non-translated S1216 RNA therein encoded, were deleted in both domestic and wild strains. γ-PGA production was analyzed by exploiting the green fluorescent protein (GFP) gene put under the control of Ppgs promoter. The fluorescence, recorded by imaging flow cytometer, can be considered as a parameter of Ppgs activation. The construct was inserted in multiple wild and domestic B. subtilis strains, deleted of degQ gene or the entire degQ locus, with either degU32Hy or degS200Hy genetic backgrounds. Data from this work evidenced that the lack of DegQ caused a delay in the activation of the TCS in the degS200Hy strains. Moreover, fluorescence data showed that wild and domestic degS200Hy strains have a different timing of Ppgs activation: fluorescence appeared considerably earlier in wild strains than in domestic ones. However, such difference is maintained in the ΔdegQ strains, suggesting that different genes, other than degQ, are responsible for the distinct expression timing of Ppgs in wild and domestic strains. Results from this work also provided further support to the notion that the DegU32Hy protein is structurally and functionally different from wild-type DegU⁓P, as obtained in the degS200Hy mutant background. The role of DegQ was further investigated in competence and flagellar motility by comparing strains carrying either degQ+ or ΔdegQ alleles. Motility assays of wild strains reveled that DegQ is not a relevant regulator of swimming and swarming motility. The interpretation of competence data was complicated because of the very high variability due to swrA+ reversion to swrA-, and vice versa during the long incubation of these assays. The alteration of the swrA allele status causes important variations in transformation efficiency and therefore high standard errors. Nonetheless, this work evidenced that DegQ has a dual role in competence regulation: in normal conditions (degSUwt), it negatively regulates competence development, whereas in degS200Hy backgrounds, it mildly stimulates the entry into the K-state.

Effetto della delezione di degQ sui fenotipi della fase stazionaria in B. subtilis. Bacillus subtilis è un batterio aerobio obbligato, adottato come organismo modello dei batteri Gram-positivi e definito solitamente un “batterio del suolo”. L’adattamento alla vita nel suolo è un processo impegnativo a causa della scarsa quantità di nutrienti. Per sopravvivere in questo ambiente, B. subtilis è in grado di entrare in uno stato noto come fase stazionaria, durante il quale viene interrotta la crescita ma mantenuto attivo il metabolismo. I fenotipi della fase stazionaria di B. subtilis comprendono la motilità per cercare nutrienti nell’ambiente, la competenza che permette ai batteri di acquisire DNA esogeno e la sintesi di poli-γ-glutammato (γ-PGA) per garantire ai batteri un guscio esterno di idratazione. DegU è un regolatore pleiotropico attivo durante la fase stazionaria che, nella sua forma fosforilata, riconosce e in seguito si lega ai promotori di numerosi geni target. DegU è parte del sistema a due componenti (TCS) DegSU e si attiva a seguito alla fosforilazione ad opera della chinasi DegS. Alcune mutazioni nei geni degS e degU sono caratterizzate dalla iperproduzione di enzimi degradativi (fenotipo Hy) e quindi denominate rispettivamente degS200Hy e degU32Hy. Un altro tipo di mutazione Hy è nel gene che codifica DegQ, un piccolo polipeptide in grado di stimolare il trasferimento di un gruppo fosfato da DegS~P a DegU. La variazione degQ36Hy, presente solo nei cappi selvatici, è caratterizzata da un incremento di dieci volte della trascrizione di degQ. Lo scopo di questa tesi è definire il ruolo di DegQ nella regolazione dei diversi fenotipi della fase stazionaria controllati dal TCS DegSU. Per analizzare il ruolo di DegQ, il gene e l’intero locus, che include l’RNA non codificante S1216 che precede il gene, sono stati deleti sia in ceppi di laboratorio che in quelli selvatici. La produzione di γ-PGA è stata valutata mediante l’analisi dell’espressione del gene codificante per la proteina fluorescente verde (GFP) inserito sotto il controllo del promotore Ppgs. La fluorescenza, registrata tramite citometria a flusso, è considerata come un parametro dell’attivazione del promotore Ppgs. Il costrutto è stato inserito in diversi ceppi di B. subtilis sia selvatici che di laboratorio, deleti del gene degQ o dell’intero locus e con entrambi i contesti genetici degU32Hy e degS200Hy. I dati ottenuti hanno evidenziato che la mancanza di DegQ causa un ritardo nell’attivazione del TCS nei ceppi degS200Hy. Inoltre, i dati relativi alla fluorescenza hanno indicato una differenza nel tempo di attivazione del promotore Ppgs tra i ceppi di laboratorio e selvatici con la mutazione degS200Hy: la fluorescenza appare nettamente prima nei ceppi selvatici. Poiché tale differenza si osserva anche nei ceppi ΔdegQ, è possibile concludere che altri geni, diversi da degQ, sono responsabili dell’espressione diversificata del promotore Ppgs. Inoltre, i risultati di questo lavoro forniscono supporto alla tesi secondo la quale la proteina degU32Hy è diversa strutturalmente e funzionalmente dalla proteina DegU⁓P ottenuta grazie alla mutazione degS200Hy. Il ruolo di DegQ è stato esaminato anche nella motilità flagellare e nella competenza, confrontando i ceppi degQ+ con i ceppi ΔdegQ. Le analisi della motilità flagellare hanno rivelato che DegQ non è un importante regolatore della motilità swimming e swarming. Interpretare i test di competenza è stato complicato a causa dell’alta variabilità che caratterizza gli esperimenti, dovuta alla reversione dell’allele swrA+ a swrA- e viceversa. I risultati di questo lavoro hanno evidenziato che DegQ ha un doppio ruolo nella regolazione della competenza: in condizioni normali (degSUwt), regola negativamente lo sviluppo della competenza mentre, in presenza della mutazione degS200Hy, stimola debolmente l’attivazione del K-state.