Ricerca avanzata

Human red blood cells (RBCs) are non-nucleated, biconcave discs of 8 um diameter that do not replicate and survive 120 days in the circulation. Decades-long investigation of the RBC membrane led to the definition of models of the membrane of living cells that evolved from very rudimentary arrangements of lipids and proteins, to the mosaic fluid model of Singer and Nicholson (1972). The RBC membrane is composed of a lipid bilayer and of a tightly coupled membrane skeleton. The latter is a protein meshwork closely associated to the cytoplasmic side of the plasma membrane, to which it confers mechanical strength, while keeping it highly flexible. The main protein in the membrane skeleton is the fibrous protein spectrin, identified for the first time in 1968. The meshwork is a highly ordered hexagonal lattice, the arms of each hexagon being formed mainly by spectrin tetramers (two spectrin dimers connected head-to-head, with each dimer composed of one a- and one b-spectrin monomers arranged in an antiparallel fashion) interconnected by junctional complexes containing actin and protein 4.1. Near the centre of a tetramer, two potential binding sites, one in each spectrin dimer, exist for the binding of ankyrin, a peripheral protein that, in turn, binds to the integral protein Band 3 to create one of the two main anchoring sites for the membrane skeleton to the lipid bilayer. With the introduction of the concept of “membrane rafts”, the fluid mosaic model had to be extended to include the asymmetric and inhomogeneous distribution of membrane components not only across the membrane but also in its plane. In the classical definition, membrane rafts are “small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes. Small rafts can sometimes be stabilized to form larger platforms through protein-protein and protein-lipid interactions”. They are thought to play important roles in the interaction and communication between cells and with the extracellular matrix. For their characterization, membrane rafts are usually isolated from cells based on their insolubility in non-ionic detergents at 4 °C in buffers of physiological pH and ionic strength, and their separation as material of low buoyance in density gradients. This detergent-resistant-membrane (DRM) is therefore usually identified with membrane rafts, although this concept is still controversial and debated. There are only a few studies concerning membrane rafts in RBCs and most of them are flawed. With our work, we have demonstrated that the standard protocol used for the extraction of DRMs, based on the simple treatment of cells with the non-ionic detergent at 4 °C, cannot be used for RBCs, where the DRMs are anchored to the spectrin-based membrane skeleton by electrostatic interactions that can only be broken by increasing the pH and the ionic strength of the extraction medium. Despite many efforts, the molecular players responsible for this electrostatic anchoring have not been identified until now. As we propose, the unusually tight association between membrane rafts and the membrane skeleton in RBCs may serve the scope of conferring additional mechanical strength to the otherwise unstable lipid bilayer, in addition to the traditional ankyrin- and actin-mediated anchoring sites. The reason why others claimed to be able to isolate membrane rafts as DRM from RBCs without increasing pH and ionic strength of the medium is that their RBC samples were contaminated by neutrophils. This led to extensive proteolysis of RBC proteins by the proteases released from neutrophils during detergent treatment, allowing the dislodgment of the DRM from the now disrupted membrane skeleton.

Tentativo di localizzazione del sito di legame dei raft di membrana al membranoscheletro di spettrina nei globuli rossi umani: evidenze ricavate da un artefatto proteolitico. I globuli rossi (G) umani sono cellule anucleate a forma di disco biconcavo di 8 um di diametro, che non si replicano e sopravvivono 120 giorni nel sistema circolatorio. Decenni di ricerche sulla membrana dei GR hanno prodotto modelli sempre più raffinati della membrana cellulare, da rudimentali agglomerati di proteine e lipidi fino al modello a mosaico fluido di Singer e Nicolson (1972). La membrana del GR è composta di un doppio strato lipidico e di un membranoscheletro ad esso saldamente ancorato. Il membranoscheletro è una rete proteica bidimensionale che si estende immediatamente a ridosso del versante citoplasmatico del doppio strato lipidico, al quale conferisce robustezza meccanica mantenendo contemporaneamente flessibile la membrana stessa. La principale proteina del membranoscheletro è la proteina filamentosa spettrina, identificata per la prima volta nel 1968. Il membranoscheletro è una rete di elementi esagonali, con i lati di ogni esagono costituiti principalmente da tetrameri di spettrina (due dimeri di spettrina associati longitudinalmente testa-testa, con ciascun dimero composto da una molecola di a- e una di b-spettrina allineate in modo antiparallelo) connessi tra loro da complessi giunzionali contenenti actina e proteina 4.1. In prossimità della zona centrale di un tetramero si trovano due potenziali siti di legame, uno in ciascun dimero, per l’anchirina, una proteina periferica che a sua volta si lega alla proteina integrale di membrana Banda 3, formando uno dei due più importanti siti di ancoraggio del membranoscheletro alla membrana plasmatica. Con l’introduzione del concetto di “raft di membrana”, il modello a mosaico fluido dovette essere esteso per contemplare che esistesse una distribuzione asimmetrica in senso laterale nel piano della membrana delle varie componenti, e non solo la loro già nota organizzazione trasversale (tra un versante e l’altro della membrana). Secondo la definizione classica, i raft di membrana sono “piccoli domini (10-200 nm) di membrana di composizione eterogenea e dinamica, arricchiti in steroli e sfingolipidi, che compartimentalizzano i processi cellulari. Piccoli raft possono a volte essere stabilizzati in piattaforme più larghe grazie ad interazioni proteine-proteine e proteine-lipidi”. Si ritiene che svolgano ruoli iportanti nell’interazione tra cellule e con la matrice extracellulare. Per poterli caratterizzare i raft di membrana vengono solitamente isolate dalle membrane cellulari sulla base della loro insolubilità in detergenti non-ionici a 4 C in soluzioni acquose di a pH e composizione ionica fisiologica. Dopo questo trattamento i raft sono isolati mediante centrifugazione in gradienti di densità come materiale a bassa densità di galleggiamento. Questa “membrana resistente al detergente” (DRM) è quindi solitamente identificata con i raft di membrana anche se questo concetto è ancora dibattuto in quanto controverso. Sono disponibili relativamente pochi studi sui raft di membrana isolati dai GR e la maggior parte di questi è inficiato da artefatti sperimentali. Infatti nel nostro laboratorio abbiamo dimostrato che il protocollo standard per l’estrazione dei DRM, basato sul trattamento delle cellule con il detergente non-ionico a 4 °C non è applicabile ai GR. In queste cellule, infatti, i DRM sono ancorati al membranoscheletro mediante interazioni elettrostatiche che possono essere rotte solamente aumentando il pH e la forza ionica del mezzo di estrazione contenente il detergente. Nonostante numerosi tentativi, l’identità delle molecole responsabili dell’ancoraggio elettrostatico dei raft al membranoscheletro è ancora sconosciuta.

Attempts to localize the binding site for membrane rafts on the spectrin skeleton in human red blood cells: insights from a proteolytic artefact

LE, LAM VU
2021/2022

Abstract

Human red blood cells (RBCs) are non-nucleated, biconcave discs of 8 um diameter that do not replicate and survive 120 days in the circulation. Decades-long investigation of the RBC membrane led to the definition of models of the membrane of living cells that evolved from very rudimentary arrangements of lipids and proteins, to the mosaic fluid model of Singer and Nicholson (1972). The RBC membrane is composed of a lipid bilayer and of a tightly coupled membrane skeleton. The latter is a protein meshwork closely associated to the cytoplasmic side of the plasma membrane, to which it confers mechanical strength, while keeping it highly flexible. The main protein in the membrane skeleton is the fibrous protein spectrin, identified for the first time in 1968. The meshwork is a highly ordered hexagonal lattice, the arms of each hexagon being formed mainly by spectrin tetramers (two spectrin dimers connected head-to-head, with each dimer composed of one a- and one b-spectrin monomers arranged in an antiparallel fashion) interconnected by junctional complexes containing actin and protein 4.1. Near the centre of a tetramer, two potential binding sites, one in each spectrin dimer, exist for the binding of ankyrin, a peripheral protein that, in turn, binds to the integral protein Band 3 to create one of the two main anchoring sites for the membrane skeleton to the lipid bilayer. With the introduction of the concept of “membrane rafts”, the fluid mosaic model had to be extended to include the asymmetric and inhomogeneous distribution of membrane components not only across the membrane but also in its plane. In the classical definition, membrane rafts are “small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes. Small rafts can sometimes be stabilized to form larger platforms through protein-protein and protein-lipid interactions”. They are thought to play important roles in the interaction and communication between cells and with the extracellular matrix. For their characterization, membrane rafts are usually isolated from cells based on their insolubility in non-ionic detergents at 4 °C in buffers of physiological pH and ionic strength, and their separation as material of low buoyance in density gradients. This detergent-resistant-membrane (DRM) is therefore usually identified with membrane rafts, although this concept is still controversial and debated. There are only a few studies concerning membrane rafts in RBCs and most of them are flawed. With our work, we have demonstrated that the standard protocol used for the extraction of DRMs, based on the simple treatment of cells with the non-ionic detergent at 4 °C, cannot be used for RBCs, where the DRMs are anchored to the spectrin-based membrane skeleton by electrostatic interactions that can only be broken by increasing the pH and the ionic strength of the extraction medium. Despite many efforts, the molecular players responsible for this electrostatic anchoring have not been identified until now. As we propose, the unusually tight association between membrane rafts and the membrane skeleton in RBCs may serve the scope of conferring additional mechanical strength to the otherwise unstable lipid bilayer, in addition to the traditional ankyrin- and actin-mediated anchoring sites. The reason why others claimed to be able to isolate membrane rafts as DRM from RBCs without increasing pH and ionic strength of the medium is that their RBC samples were contaminated by neutrophils. This led to extensive proteolysis of RBC proteins by the proteases released from neutrophils during detergent treatment, allowing the dislodgment of the DRM from the now disrupted membrane skeleton.
2021
Attempts to localize the binding site for membrane rafts on the spectrin skeleton in human red blood cells: insights from a proteolytic artefact
Tentativo di localizzazione del sito di legame dei raft di membrana al membranoscheletro di spettrina nei globuli rossi umani: evidenze ricavate da un artefatto proteolitico. I globuli rossi (G) umani sono cellule anucleate a forma di disco biconcavo di 8 um di diametro, che non si replicano e sopravvivono 120 giorni nel sistema circolatorio. Decenni di ricerche sulla membrana dei GR hanno prodotto modelli sempre più raffinati della membrana cellulare, da rudimentali agglomerati di proteine e lipidi fino al modello a mosaico fluido di Singer e Nicolson (1972). La membrana del GR è composta di un doppio strato lipidico e di un membranoscheletro ad esso saldamente ancorato. Il membranoscheletro è una rete proteica bidimensionale che si estende immediatamente a ridosso del versante citoplasmatico del doppio strato lipidico, al quale conferisce robustezza meccanica mantenendo contemporaneamente flessibile la membrana stessa. La principale proteina del membranoscheletro è la proteina filamentosa spettrina, identificata per la prima volta nel 1968. Il membranoscheletro è una rete di elementi esagonali, con i lati di ogni esagono costituiti principalmente da tetrameri di spettrina (due dimeri di spettrina associati longitudinalmente testa-testa, con ciascun dimero composto da una molecola di a- e una di b-spettrina allineate in modo antiparallelo) connessi tra loro da complessi giunzionali contenenti actina e proteina 4.1. In prossimità della zona centrale di un tetramero si trovano due potenziali siti di legame, uno in ciascun dimero, per l’anchirina, una proteina periferica che a sua volta si lega alla proteina integrale di membrana Banda 3, formando uno dei due più importanti siti di ancoraggio del membranoscheletro alla membrana plasmatica. Con l’introduzione del concetto di “raft di membrana”, il modello a mosaico fluido dovette essere esteso per contemplare che esistesse una distribuzione asimmetrica in senso laterale nel piano della membrana delle varie componenti, e non solo la loro già nota organizzazione trasversale (tra un versante e l’altro della membrana). Secondo la definizione classica, i raft di membrana sono “piccoli domini (10-200 nm) di membrana di composizione eterogenea e dinamica, arricchiti in steroli e sfingolipidi, che compartimentalizzano i processi cellulari. Piccoli raft possono a volte essere stabilizzati in piattaforme più larghe grazie ad interazioni proteine-proteine e proteine-lipidi”. Si ritiene che svolgano ruoli iportanti nell’interazione tra cellule e con la matrice extracellulare. Per poterli caratterizzare i raft di membrana vengono solitamente isolate dalle membrane cellulari sulla base della loro insolubilità in detergenti non-ionici a 4 C in soluzioni acquose di a pH e composizione ionica fisiologica. Dopo questo trattamento i raft sono isolati mediante centrifugazione in gradienti di densità come materiale a bassa densità di galleggiamento. Questa “membrana resistente al detergente” (DRM) è quindi solitamente identificata con i raft di membrana anche se questo concetto è ancora dibattuto in quanto controverso. Sono disponibili relativamente pochi studi sui raft di membrana isolati dai GR e la maggior parte di questi è inficiato da artefatti sperimentali. Infatti nel nostro laboratorio abbiamo dimostrato che il protocollo standard per l’estrazione dei DRM, basato sul trattamento delle cellule con il detergente non-ionico a 4 °C non è applicabile ai GR. In queste cellule, infatti, i DRM sono ancorati al membranoscheletro mediante interazioni elettrostatiche che possono essere rotte solamente aumentando il pH e la forza ionica del mezzo di estrazione contenente il detergente. Nonostante numerosi tentativi, l’identità delle molecole responsabili dell’ancoraggio elettrostatico dei raft al membranoscheletro è ancora sconosciuta.
CIANA, ANNARITA
Lauree Magistrali
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14239/14873