Nitrate supplementation attenuates neuromuscular dysfunctions in age-related sarcopenic mice

Sarcopenia is an age-related multifactorial disease with an increasing incidence in the global population. Sarcopenia is characterised by skeletal muscle atrophy and progressive reduction of force production, higher risks of falling and developing comorbidities. Many age-related alterations of the physiological homeostasis of the organism could contribute to the development of sarcopenia, among which is a disturbance of the protein turnover equilibrium and denervation-related neuromuscular dysfunctions. The neuromuscular junction (NMJ) is a chemical synapsis that works as the point of contact between the peripheral nervous system and the skeletal muscle, changing the electrical stimulus into a chemical one that, when released, starts the signalling cascade, which determines muscle contraction. During the individual lifespan, NMJs are subjected to physiological cycles of denervation/reinnervation; however, during ageing, there is an increase in the number of myofibers in which denervation has occurred and cannot be successfully reinnervated. Denervation determines the atrophy of the fibre and, in time, its death. This age-related phenomenon is characterised by the overexpression of denervation-related factors, such as HDAC4, Gadd45a, MyoG, AChR gamma, and NCAM1. As such, NMJ deterioration is considered one of the driver phenomena of age-related skeletal muscle impairments, such as sarcopenia. Nitric oxide (NO) is an essential neurotransmitter whose availability is reduced in ageing individuals, contributing to the loss of skeletal muscle mass, NMJ and mitochondrial impairments. We performed a 2-month nitrate supplementation intervention (1.5 mM inorganic NaNO3) on male 22-month-old mice (Old-N cohort) to determine the effects of nitrates on the NMJ and skeletal muscle trophism. At 24-month-old, we sacrificed elderly treated mice (Old-N group) and elderly control mice (Old-CTRL group), while Young-CTRL mice were sacrificed at 7-month-old. We initially compared the Old-CTRL group to the Young-CTRL to identify the age-related variations at the level of NMJ (NMJ morphometry and expression of denervation-related factors) and muscle trophism (morphometry and key molecular pathways of protein synthesis and protein breakdown). Then, we compared the Old-N group with the Old-CTRL to determine the effects of nitrate supplementation. Nitrates intervention stimulated anabolic response through higher phosphorylated and total content of factors involved in protein synthesis (p70S6K and S6) compared with the Old-CTRL group. This result was in agreement with the increase in the cross-sectional area of the Gastrocnemius muscle in the Old-N cohort, compared to the Old-CTRL. Furthermore, the NMJ morphology of treated mice showed a positive remodelling (evaluated through confocal microscopy) when confronted with the old controls. Also, the innervation of muscle fibres was improved after nitrates treatment in agreement with the decrease in the NMJ fragmentation (-11%, p=0.01) and NCAM1-positive fibres (-42%; p=0.009). Our data indicate that nitrate supplementation could attenuate age-related neuromuscular dysfunction in the skeletal muscle.

L'integrazione di nitrati attenua le disfunzioni neuromuscolari in topi affetti da sarcopenia dovuta all'invecchiamento. La sarcopenia è una patologia multifattoriale con una progressiva incidenza nella popolazione mondiale. È caratterizzata da atrofia del muscolo scheletrico e da una progressiva riduzione della forza generata, aumentando i rischi di caduta e di sviluppo di comorbidità. Molte alterazioni dell’omeostasi fisiologica, legate all’invecchiamento, contribuiscono allo sviluppo della sarcopenia, tra le quali sono da annoverare il disturbo dell’equilibrio del turnover proteico e le disfunzioni neuromuscolari legate alla denervazione. La giunzione neuromuscolare è una sinapsi chimica che si comporta come punto di contatto tra il sistema nervoso periferico e il muscolo scheletrico, trasformando lo stimolo elettrico in uno chimico che, quando rilasciato, da inizio ad una cascata di segnalazione che determina la contrazione muscolare. Durante la vita dell’individuo, le giunzioni neuromuscolari sono sottoposte a cicli fisiologici di denervazione/innervazione; tuttavia, durante l’invecchiamento, c’è un aumento del numero di fibre muscolari che hanno subito denervazione e che non sono state reinnervate. Questo fenomeno legato all’invecchiamento è caratterizzato dall’over-espressione di fattori legati alla denervazione, quali HDAC4, Gadd45a, MyoG, AChR gamma, e NCAM1. Di conseguenza, il deterioramento delle giunzioni neuromuscolari è considerato uno dei principali fenomeni legato all’invecchiamento che determinano danneggiamento del muscolo scheletrico, quale la sarcopenia. L’ossido nitrico (NO) è un neurotrasmettitore essenziale la cui disponibilità è ridotta negli individui di età avanzata, contribuendo alla perdita di massa muscolare e a disfunzioni della giunzione neuromuscolare e dei mitocondri. Abbiamo eseguito un trattamento di integrazione di nitrati (1.5 mM NaNO3 inorganico) per un periodo di due mesi su topi maschi di 22 mesi (Old-N) con l’obiettivo di determinare gli effetti dei nitrati sulle giunzioni neuromuscolari e sul trofismo del muscolo scheletrico. A 24 mesi, abbiamo sacrificato i topi anziani trattati (Old-N) e i topi anziani di controllo (Old-CTRL), mentre i topi giovani di controllo sono stati sacrificati a 7 mesi. Abbiamo inizialmente confrontato il gruppo Old-CTRL and quello Young-CTRL per identificare le variazioni legate all’età a livello delle giunzioni neuromuscolari (morfometria ed espressione di fattori legati alla denervazione) e del trofismo muscolare (morfometria e principali pathways molecolari legati alla sintesi proteica e alla degradazione delle proteine). In seguito, abbiamo confrontato il gruppo Old-N con il gruppo di controllo di topi anziani per determinare gli effetti dell’integrazione con nitrati. L’intervento con nitrati ha stimolato una risposta anabolica attraverso l’aumento di fosforilazione e il contenuto totale di fattori coinvolti nella sintesi proteica (p70S6K e S6) in confronto con il gruppo Old-CTRL. Questo risultato è in accordo con l’aumento della cross-sectional area del muscolo Gastrocnemius nella coorte Old-N, confrontata con quella Old-CTRL. Inoltre, la morfologia delle giunzioni neuromuscolari dei topi trattati ha dimostrato un rimodellamento positivo (valutato attraverso la microscopia confocale) quando confrontate con quelle di topi anziani di controllo. Inoltre, l’innervazione delle fibre muscolari è migliorata in seguito a trattamento con nitrati, in accordo con una diminuita frammentazione della giunzione neuromuscolare (-11%, p=0.01) e delle fibre positive ad NCAM1 (-42%; p=0.009). I nostri dati suggeriscono che l’integrazione con nitrati sia in grado di attenuare le disfunzioni neuromuscolari legate all’età nel muscolo scheletrico.